蘇云金芽孢桿菌vip3A基因及殺蟲防病工程菌研究.pdf

1、營(yíng)養(yǎng)期殺蟲蛋白(vegetativeinsecticidal proteins,VIPs)是蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thruingiensis,Bt)在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期分泌的一類新型殺蟲毒蛋白,它對(duì)鱗翅目昆蟲具有較廣譜的殺蟲活性.Vip3A蛋白通過誘發(fā)細(xì)胞凋亡,最終導(dǎo)致昆蟲死亡,這種作用機(jī)理與Bt殺蟲晶體蛋白(insecticidal crystal proteins,ICPs)的作用機(jī)理完全不同.該文對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的菌株進(jìn)行vip

2、3A基因的檢測(cè),克隆了vip3A-WB5基因并在大腸桿菌中得到高效表達(dá).應(yīng)用生物信息學(xué)對(duì)vip3A-WB5基因的序列進(jìn)行了分析.將vip3A-WB5基因?qū)刖哂蟹啦?、?nèi)生和促生功能的野生枯草芽孢桿菌中,構(gòu)建了多功能工程菌.用PCR方法對(duì)該室保存的菌株篩選獲得30株含有vip3A基因.從中挑選對(duì)夜蛾科(Noctuidae)害蟲具有較高毒力的WB5菌株,進(jìn)行vip3A基因的克隆和測(cè)序.將克隆的vip3A-WB5基因插入表達(dá)載體pET29a(

3、+),構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pETvip-WB5,將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21,經(jīng)1mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)89kDa大小的Vip3A蛋白.將Vip3A蛋白對(duì)斜紋夜蛾的2齡幼蟲進(jìn)行生物測(cè)定,結(jié)果表明具有較高的殺蟲活性.蛋白可溶性試驗(yàn)表明,目的蛋白大部分可溶,透射電鏡觀察無包含體存在,其原因有待進(jìn)一步研究.在自然條件下進(jìn)行了目的蛋白的純化,并將純化的蛋白對(duì)家兔進(jìn)行免疫而制備多克隆抗體.將克隆的vip3A-WB5基因插入枯草芽孢桿菌的分泌型表

4、達(dá)載體pUS186,構(gòu)建重組分泌型表達(dá)質(zhì)粒pUS186vip-WB5,將其轉(zhuǎn)化到具防病、內(nèi)生和促生的野生型枯草芽孢桿菌BS2中.對(duì)工程菌、WB5和BS2室內(nèi)抑菌、內(nèi)生和促生作用的實(shí)驗(yàn)表明:工程菌和BS2抑菌活性相當(dāng),WB5無抑菌作用;工程菌和BS2能在白菜體內(nèi)內(nèi)生定殖,WB5無內(nèi)生作用;工程菌、WB5和BS2菌液浸種白菜15d后鮮重分別增加155.89％、158.54％和145.27％,對(duì)白菜苗都具有促生作用,蘇云金芽孢桿菌WB5對(duì)白菜