Bt殺蟲基因vip3A（a）轉(zhuǎn)化芽孢桿菌TB2的研究.pdf

1、根據(jù)GenBank上登錄的Bacillus subtili．subsp.subtilis str．168(簡(jiǎn)稱BS168)序列(NC000964)，設(shè)計(jì)出包含兩種不同限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的1對(duì)擴(kuò)增rpsD啟動(dòng)子序列的特異旨物RpsF/RpsR，用PCR方法從BSl68的總DNA中擴(kuò)增出rpsD啟動(dòng)子基因，命名為rpsD。并根據(jù)已經(jīng)在GenBank上登錄的Bt vip3A(a)基因序列，設(shè)計(jì)出包含兩種不同的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的1對(duì)特異弓i物ri

2、p-F/vip-R，以含有對(duì)鱗翅目夜蛾科害蟲具有廣譜高效殺蟲活性基因vip3A(a)的蘇云金芽孢桿菌(B.thuringiensis，Bt)菌株Bt-WB7的總DNA為模板，用PCR方法擴(kuò)增出vip3A(a)基因。再將rpsp和vip3A(a)基因的PCR產(chǎn)物分別用Nde I單酶切，之后將兩個(gè)單酶切產(chǎn)物用T4連接酶連接。以連接產(chǎn)物為模板，用RpsF/vip-R為引物，擴(kuò)增啟動(dòng)子-vip基因序列，將PCR產(chǎn)物直接連接到pMD-18T克隆載

3、體上轉(zhuǎn)入大腸桿菌(Escherichia coli)JM109。挑取陽性克隆，提取重組質(zhì)粒pMD-p-vip進(jìn)行酶切與PCR驗(yàn)證后進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序驗(yàn)證正確的啟動(dòng)子-vip基因，用EcoR I和Xba I雙酶切從pMD-p-vip重組質(zhì)粒上切下，回收目的片段與用相同酶切的表達(dá)載體Pgfp4412相連，得到重組原核表達(dá)質(zhì)粒pVipgfp。將重組原核表達(dá)質(zhì)粒pVipgfp轉(zhuǎn)化解淀粉鏈芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens

4、)受體菌株TB2中，挑取轉(zhuǎn)化子用PCR檢測(cè)重組質(zhì)粒pViPgfP導(dǎo)入情況，最后通過生物測(cè)定篩選得到能高效表達(dá)Bt vip3A(a)基因的TB2-16工程菌。研究表明TB2-16工程菌株培養(yǎng)液對(duì)斜紋夜蛾幼蟲的具有很高的毒殺作用；抑菌實(shí)驗(yàn)表明TB2-16工程菌株對(duì)大豆炭疽病菌、柑橘炭疽病菌、黃瓜枯萎病菌、西瓜枯萎病菌、番茄早疫病菌5種病原菌的抑制效果與TB2無明顯差異，而且菌落形態(tài)基本上保持不變：內(nèi)生和對(duì)植物生長(zhǎng)影響研究表明TB2-16具有