山楂再生體系建立與農(nóng)桿菌介導(dǎo)Bt基因轉(zhuǎn)化的研究.pdf

1、山楂是中國(guó)重要果樹(shù)之一，果實(shí)含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是鮮食與藥用的上等補(bǔ)品，且山楂樹(shù)冠整齊，花葉并茂是較好的觀賞和綠化樹(shù)種。生產(chǎn)上山楂蟲(chóng)害發(fā)生相當(dāng)嚴(yán)重，造成產(chǎn)量和品質(zhì)的損失。為害山楂的害蟲(chóng)主要是鱗翅目害蟲(chóng)，其中主要包括食心蟲(chóng)、木蠹蛾等，不但危害果實(shí)，還咬食葉片和樹(shù)干等。一些優(yōu)良的品種由于蟲(chóng)害的破壞，品種不斷的退化，已瀕臨滅絕。 由于在已有的種質(zhì)資源中很難找到可用的抗蟲(chóng)材料，使山楂在抗蟲(chóng)方面的常規(guī)育種受到限制。植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的廣泛應(yīng)用

2、，使通過(guò)生物工程方法培育具有優(yōu)良性狀的果樹(shù)新品種成為可能，本研究也運(yùn)用這一技術(shù)開(kāi)展了山楂組培與轉(zhuǎn)基因研究。獲得了大果山楂三個(gè)品種無(wú)菌試管苗，首次建立了遼紅山楂葉片再生體系，并在此基礎(chǔ)上，研究了農(nóng)桿菌介導(dǎo)Bt基因轉(zhuǎn)化的條件，獲得了轉(zhuǎn)基因植株。主要試驗(yàn)結(jié)果如下： 1．無(wú)菌試管苗的獲得 從選擇外植體開(kāi)始，比較了單芽與帶芽莖段在相同時(shí)間內(nèi)HgCl<,2>滅菌的污染率、褐化率和死亡率，進(jìn)而確定單芽為外植體更適合。單芽HgCl<,2

3、>消毒7min為宜，污染少，萌發(fā)率高。根據(jù)外植體在不同培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況，確定MS為基本培養(yǎng)基。利用正交試驗(yàn)分析了遼紅山楂試管苗伸長(zhǎng)與增殖的激素濃度配比，確定了腋芽增殖培養(yǎng)基：MS+BA2.0+NAA0.02和繼代培養(yǎng)基：MS+BA1.0mg/L+GA<,3>0.3mg/L+NAA0.02mg/L。 2．遼紅山楂生根試驗(yàn) 進(jìn)行了基本培養(yǎng)基與激素等影響因素的篩選試驗(yàn)，結(jié)果表明基本培養(yǎng)基1/2MS優(yōu)于1/4MS，生長(zhǎng)素IBA

4、優(yōu)于NAA，IBA和NAA配合使用的效果則更好，培養(yǎng)基中添加20g/L的蔗糖生根效果最佳。最佳的生根培養(yǎng)基為 1/2MS+IBA0.6mg/L+NAA0.2mg/L+20g/L蔗糖+7g/L瓊脂。 3．遼紅山楂葉片再生體系的建立 3.1 愈傷組織的誘導(dǎo) 研究了基因型、暗培養(yǎng)時(shí)間、不同激素、培養(yǎng)基類(lèi)型等因素對(duì)遼紅山楂葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響。相同培養(yǎng)條件下，不同的基因型愈傷組織誘導(dǎo)差異很顯著，遼紅山楂的葉片愈傷組織誘

5、導(dǎo)率最高；其次為秋金星；大旺最差，未誘導(dǎo)出愈傷組織。一定時(shí)期的暗培養(yǎng)是山楂葉片誘導(dǎo)的必要條件，暗培養(yǎng)5～9d與15～20d的愈傷組織在形態(tài)上有著明顯的差異，暗培養(yǎng)7d最佳。BA及TDZ與NAA的組合都可以誘導(dǎo)葉片產(chǎn)生愈傷組織，但是由BA和NAA誘導(dǎo)的愈傷組織硬度大，顏色墨綠，易褐化，20天后大部分即已褐化死亡，而TDZ與NAA配比誘導(dǎo)的愈傷硬度相對(duì)較小，顏色翠綠，褐化程度較輕，比較適合再分化和繼代培養(yǎng)，所以MS培養(yǎng)基比較適合遼紅山楂葉片

6、愈傷組織的誘導(dǎo)。遼紅葉片愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS+TDZ1.0mg/L+NAA0.05 mg/L。 3.2 愈傷組織再生不定芽 以MS和WPM兩種培養(yǎng)基上誘導(dǎo)的愈傷組織為材料，進(jìn)行了再生不定芽比較試驗(yàn)，篩選出再分化培養(yǎng)基WPM+BA2.0mg/L +KT0.5mg/L +NAA0.02mg/L。通過(guò)Cef對(duì)遼紅山楂愈傷組織再分化的影響以及無(wú)根試管苗對(duì)Kan抗性預(yù)備試驗(yàn)，基本上確定了遺傳轉(zhuǎn)化中抗生素最佳濃度為 Cef50