木薯“西選03”再生體系建立及農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化初探.pdf

1、廣西是我國(guó)木薯種植第一大省，圍繞木薯淀粉加工形成的一系列木薯加工產(chǎn)業(yè)鏈，是廣西經(jīng)濟(jì)組成的重要部分?！拔鬟x03”是廣西大學(xué)選育的木薯優(yōu)良品種，耐旱、產(chǎn)量高，具有較高的經(jīng)濟(jì)和推廣價(jià)值，采用轉(zhuǎn)基因方法把抗逆基因?qū)雰?yōu)良木薯品種中可有效提高抗逆性，改良木薯品種。本試驗(yàn)主要研究以“西選03”幼嫩莖段腋芽為外植體建立快繁體系、以獲得的無(wú)菌苗幼嫩葉片為材料建立離體葉片再生體系以及初步建立農(nóng)桿菌介導(dǎo)的無(wú)菌葉片遺傳轉(zhuǎn)化體系，結(jié)果如下:
　　1.外植

2、體滅菌:經(jīng)過(guò)0.1％ KMnO4預(yù)處理10 min和75％酒精浸泡20 s后，大田栽培、室內(nèi)水培、大棚沙培來(lái)源的外植體用0.1％ HgCl2分別滅菌10min、5 min、6min效果最好，污染率分別為30.8％、11.1％、17.1％，成活率分別可達(dá)61.5％、80.0％、74.4％。
　　2.初代培養(yǎng):添加低濃度6-BA的培養(yǎng)基中外植體腋芽萌發(fā)優(yōu)于KT和TDZ，最適宜初代誘導(dǎo)的培養(yǎng)基為MS+6-BA0.05 mg/L，外植體在

3、一周內(nèi)萌發(fā)，萌芽率達(dá)90.0％，萌發(fā)芽長(zhǎng)勢(shì)良好。
　　3.繼代增殖:單芽增殖培養(yǎng)宜采用MS+6-BA0.1 mg/L培養(yǎng)基，芽增殖倍數(shù)可達(dá)4.6;密集叢生芽培養(yǎng)宜采用MS+6-BA0.3 mg/L+GA30.5 mg/L培養(yǎng)基;無(wú)菌芽壯苗培養(yǎng)宜采用MS+ PP3333.0 mg/L培養(yǎng)基，無(wú)菌芽節(jié)間縮短、增粗。
　　4.生根:單獨(dú)添加NAA、PP333或者直接用MS培養(yǎng)基均可誘導(dǎo)無(wú)菌芽生根，其中以MS+PP3330.3 mg

4、/L誘導(dǎo)生根效果較好，根短而粗壯，生根率達(dá)100％，平均根數(shù)6.9。
　　5.生根苗移栽:取生根3條左右，株高3～4 cm的健壯組培苗移栽至草炭∶蛭石∶菜園土=1∶1∶1的基質(zhì)中，30 d成活率可達(dá)55.1％。
　　6.愈傷組織誘導(dǎo):MS+毒莠定12 mg/L+CuSO40.5 mg/L適合作為無(wú)菌葉片愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，出愈率達(dá)100％。形成愈傷組織呈淡黃色，部分愈傷組織塊表面有顆粒狀突起。
　　7.愈傷組織繼代:最

5、佳的愈傷組織繼代培養(yǎng)基為1/2MS+毒莠定12 mg/L，增殖率達(dá)86.7％，用此培養(yǎng)基繼代，可使硬化愈傷組織塊變得疏松，表面顆粒狀突起明顯，為轉(zhuǎn)化成胚性愈傷組織做準(zhǔn)備。
　　8.愈傷組織分化誘導(dǎo):采用生長(zhǎng)素類(lèi)與細(xì)胞分裂素類(lèi)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配合使用誘導(dǎo)愈傷組織產(chǎn)生不定芽，分化率極低。采用MS+6-BA1.0 mg/L+ IAA0.5 mg/L+AgNO30.5 mg/L+CuSO40.5 mg/L培養(yǎng)基可一定程度上提高不定芽的分化率

6、，但仍然不足15％。
　　9.抗生素篩選:分別對(duì)帶腋芽莖段、無(wú)菌葉片和愈傷組織塊進(jìn)行抗生素Km耐受壓篩選，結(jié)果表明，三種材料的抗生素選擇壓培養(yǎng)基分別為MS+6-BA0.05 mg/L+ Km400 mg/L、MS+毒莠定12 mg/L+ Km200 mg/L和MS+毒莠定12 mg/L+Km150 mg/L。
　　10.農(nóng)桿菌侵染無(wú)菌葉及GFP基因熒光檢測(cè):農(nóng)桿菌侵染無(wú)菌葉以20 min效果最好，GFP熒光表達(dá)率可達(dá)63.3