四季海棠(Begonia semperflorens)高頻再生及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立.pdf

1、四季海棠(Begoniasemperflorens)的很多栽培品種因其性狀穩(wěn)定、花期整齊，觀賞效果好而廣泛用于城市綠化中。由于四季海棠主要原產(chǎn)南美巴西，其最生長適溫度為20℃左右，對低溫冷害比較敏感。隨著分子生物學(xué)技術(shù)研究的迅速發(fā)展，利用基因工程手段改良四季海棠抗寒性變得切實可行，為提高四季海棠的抗寒性提供了全新的途徑。根癌農(nóng)桿菌（Agrobacteriumtumefaciens）作為遺傳轉(zhuǎn)化載體成本低廉、轉(zhuǎn)化效率高，是應(yīng)用最廣泛的外源

2、基因?qū)敕āＧ叭搜芯堪l(fā)現(xiàn)蠟梅Cpcor413pm1基因轉(zhuǎn)入在煙草中，能有效提高煙草的抗寒性。有關(guān)四季海棠遺傳轉(zhuǎn)化的研究，目前鮮有報道。本實驗在以四季海棠葉片建立再生體系的基礎(chǔ)上，以蠟梅Cpcor413pm1基因為外源目的基因，利用根癌農(nóng)桿菌進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，以期獲得抗寒能力提高的四季海棠新品種或新材料。主要研究結(jié)果如下:
　　 1、四季海棠再生體系建立
　　 以四季海棠幼嫩葉片為外植體，以MS為基本培養(yǎng)基，通過添加不同濃度的

3、6-BA和IBA設(shè)計不同的培養(yǎng)基，研究四季海棠葉盤直接分化不定芽的最適分化條件。從而初步建立了四季海棠的再生體系。
　　 外植體葉片表面滅菌方式為:先用洗衣粉溶液(3g/L)漂洗5-6min，流水沖洗4h，然后0.1％升汞滅菌5-6min，無菌水沖洗5-6次。最優(yōu)不定芽分化培養(yǎng)基為:1/2MS+6-BA0.5mg/L+IBA0.8mg/L，誘導(dǎo)率達(dá)83％;最優(yōu)繼代培養(yǎng)基為:MS+6-BA0.5mg/L+IBA0.8mg/L，增殖

4、系數(shù)為4.7。最優(yōu)生根培養(yǎng)基為:1/2MS+IBA0.5mg/L，30d左右可誘導(dǎo)出根，生根率可達(dá)98％。用珍珠巖∶腐殖質(zhì)=1∶2作為栽培基質(zhì)，移栽煉苗成活率91％
　　 2、根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的四季海棠遺傳轉(zhuǎn)化
　　 在農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)轉(zhuǎn)化四季海棠的體系中，卡那霉素（Kanamycin，Km）對四季海棠不定芽分化的篩選壓為50mg/L，對再生植株生根的篩選壓為100mg/L，羧芐霉素（Carbenicillin，Ca

5、rb）對農(nóng)桿菌EHA105的抑制作用優(yōu)于頭孢青霉素(Cephalothin，Cef)，篩選壓為200mg/L。
　　 分別從預(yù)培養(yǎng)時間、侵染液濃度、侵染時間和共培養(yǎng)時間4個方面，優(yōu)化四季海棠遺傳轉(zhuǎn)化體系。通過GUS基因瞬時表達(dá)的檢測，結(jié)果表明四季海棠葉片在預(yù)培養(yǎng)3d、侵染液濃度OD600=0.2、侵染10min、共培養(yǎng)3d后轉(zhuǎn)化效率最高。
　　 共培養(yǎng)培養(yǎng)基為1/2MS+6-BA0.5mg/L+IBA0.8mg/L+AS

6、100μmol/L;分化篩選培養(yǎng)基為MS+6-BA0.5mg/L+IBA0.8mg/L+Km50mg/L+Carb200mg/L;生根篩選培養(yǎng)基為:1/2MS+IBA0.5mg/L+Km100mg/L+Carb200mg/L。經(jīng)過上述方法最終獲得32株陽性的轉(zhuǎn)基因四季海棠。
　　 3、低溫脅迫下轉(zhuǎn)基因四季海棠植株生理指標(biāo)的測定
　　 低溫(4℃)處理轉(zhuǎn)基因四季海棠與對照植株（野生型）3d后，測定葉綠素、脯氨酸、丙二醛(m