棉花植株再生及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Bt基因和Bar基因的遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、棉花作為一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，對(duì)國(guó)民經(jīng)濟(jì)的發(fā)展具有舉足輕重的地位。棉花生產(chǎn)的發(fā)展與高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、多抗的新品種培育和推廣是緊密聯(lián)系的，而新品種的培育，種質(zhì)資源又具有非常重要的作用。選育生產(chǎn)上需要的新品種或創(chuàng)造種質(zhì)資源，常規(guī)育種是一種主要的方法。但是，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，利用生物技術(shù)來(lái)創(chuàng)新棉花種質(zhì)資源和培育新品種又是一條非常有效的途徑，它將極大的推動(dòng)棉花遺傳育種的發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)以三個(gè)長(zhǎng)江流域品種（鄂抗3號(hào)、泗棉3號(hào)、鄂棉23）的下胚軸進(jìn)行組織培養(yǎng)

2、，通過(guò)體細(xì)胞胚胎發(fā)生再生獲得植株；并利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，以胚性愈傷組織為受體，成功將目的抗蟲(chóng)基因（Cry9c、CryIIA）和選擇標(biāo)記抗除草劑基因（Bar基因）導(dǎo)入到上述三個(gè)品種中，現(xiàn)己獲得具有抗蟲(chóng)和抗除草劑的雙抗轉(zhuǎn)基因棉花。主要研究結(jié)果如下： 1．對(duì)體細(xì)胞胚胎發(fā)生的一些參數(shù)進(jìn)行了調(diào)整，優(yōu)化了再生體系。研究發(fā)現(xiàn)IBA／KT激素組合誘導(dǎo)出的愈傷組織狀態(tài)較好，0.25mg／uBA和0.1mg／LKT誘導(dǎo)出的愈傷在120

3、天左右時(shí)最先分化，在胚萌發(fā)培養(yǎng)基中加入400mg／L活性炭，胚萌發(fā)率和獲得正常苗的成功率最高；在7.6g／LKNO3時(shí)胚性愈傷增值量達(dá)到最大，5.7／LKNO3時(shí)子葉胚的形成率最高；再生苗的嫁接選用4-7天砧木最佳，嫁接后切除初生根系，接種在SH培養(yǎng)基上，10-15天根系發(fā)育基本達(dá)到移栽要求，煉苗7天左右，水培1天即可移栽。 2．對(duì)胚性愈傷、體細(xì)胞胚、再生苗根尖的細(xì)胞學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)7-14天胚性愈傷、未成熟胚分裂相最多，子葉胚的分

4、裂相很難找到，根尖的分裂相比較少，用對(duì)二氯苯預(yù)處理3.5小時(shí)，固定大于24小時(shí)，20-22℃5N鹽酸解離20-30分鐘后壓片，可以獲得好的分裂相，觀察效果良好。 3．通過(guò)調(diào)整一些轉(zhuǎn)化參數(shù)，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)化用農(nóng)桿菌濃度0.20D-0.50D值是比較理想的濃度；搖菌時(shí)MGL培養(yǎng)基中加入50mg／L乙酰丁香酮；轉(zhuǎn)化材料選用繼代7-14天胚性愈傷為最佳；共培養(yǎng)溫度為20℃為較適宜溫度；不同菌株對(duì)不同品種轉(zhuǎn)化效率各不相同，Cry9c對(duì)鄂棉23

5、的轉(zhuǎn)化效率最高達(dá)60％，CryIIA對(duì)泗棉3號(hào)的轉(zhuǎn)化效率最高為66.7％；在以Phytagel為凝固劑的1／2MS培養(yǎng)基中胚萌發(fā)率最高可到80％。 4．實(shí)驗(yàn)中確定以2.5mg/LPPT進(jìn)行抗性篩選濃度，減少了因篩選帶來(lái)的變異。 5．通過(guò)體細(xì)胞胚胎發(fā)生與農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，獲得了具有抗蟲(chóng)基因（Cry9c、Cry Ⅱ A）和選擇標(biāo)記抗除草劑基因（Bar基因）的雙抗轉(zhuǎn)基因棉花鄂抗3號(hào)、泗棉3號(hào)、鄂棉23植株。對(duì)轉(zhuǎn)基因再生