四株蘇云金芽孢桿菌殺蟲基因和功能蛋白多樣性分析.pdf

1、蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis，Bt)自上世紀初被發(fā)現(xiàn)以來，已成為微生物農(nóng)藥中的重要一員，為有害生物的綜合防治作出了重要貢獻。從1938年第一個Bt制劑問世以來，有文獻報道，其在微生物農(nóng)藥中所占份額達90％以上。蘇云金芽孢桿菌可以產(chǎn)生多種毒素對昆蟲、線蟲和哺乳動物有毒害作用，而且可以對人類的某些疾病治療有幫助。本研究對實驗室前期從新疆馬鈴薯甲蟲（Leptinotarsa decemlineata）上分離獲得

2、的4個具有幾丁質(zhì)酶活性的Bt菌株進行了殺蟲功能基因和蛋白研究。利用PCR-RFLP(Polymerase ChainReaction-Restriction Fragment Length Polymorphism)和特異性PCR方法，對4個Bt菌株所含有的殺蟲基因進行鑒定，分析它們的功能蛋白，并測定它們對柑桔小實蠅等害蟲的控制作用。
　　1、殺蟲基因的鑒定分析
　　根據(jù)殺蟲基因cry1-10的保守區(qū)域設計通用引物，再按照引

3、物上加入的酶切位點堿基序列選擇相應的限制性內(nèi)切酶，對擴增產(chǎn)物進行雙酶切，從限制性片段多態(tài)性圖譜（RFLP圖譜）分析其基因類型。結果表明，菌株CPB008和CPB012均含有cry1和cry2基因。將K5un3/K3un3引物擴增到的cry1基因，用PstⅠ和XbaⅠ進行雙酶切，得到1117bp，801 bp，518bp和322bp的序列。將S5un2/S3un2擴增得到的cry2基因用HincⅡ和MspⅠ進行酶切，得到958 bp，79

4、1 bp，297bp和273bp等特異性條帶。CPB016和CPB111兩個菌株未檢測到cry1-10基因。再通過設計二級分類基因特異性引物cry1A、cry1B等，鑒定菌株所含具體基因型。結果表明，CPB008含有cry1Aa、cry1Ac（GenBank登錄號:KR049190）、cry1Ia、cry2Aa(KR049192)和cry2Ab(KR049193);CPB012含有cry1Aa(KR049191)、cry1Ac、cry1

5、Ia(KJ941157)、cry2Aa(KR049194)和cry2Ab(KR049195)殺蟲功能基因。其中對具有雙元活性的cry1Ⅰa基因設計全長序列引物，擴增獲得2159 bp(CPB012)全長基因（KJ941157），其結構完整。在對cry11-cry40、vip1-3、cyt1-2基因的檢測中發(fā)現(xiàn)，CPB008和CPB016還含有vip3A基因，GenBank登錄號分別是:KR049196和KR049197。而CPB016和

6、CPB111未檢測到相關基因。cry11-40，cyt1-2以及vip1-3基因檢測參照普通PCR方法，結果顯示4個菌株除CPB008和CPB012含有vip3A基因外，其它基因均無特異性條帶。
　　2、晶體蛋白的形態(tài)觀察與SDS-PAGE
　　連續(xù)培養(yǎng)觀察不同時間菌體和晶體蛋白形態(tài)顯示，CPB008能夠產(chǎn)生菱形、不規(guī)則形和球形晶體。CPB012能夠產(chǎn)生方形、不規(guī)則形和球形晶體，而CPB016和CPB111能夠產(chǎn)生球形晶體。

7、蛋白晶體分離后進行SDS-PAGE分析，結果表明，CPB008能夠產(chǎn)生135-140 kDa、80 kDa、70 kDa的特異性蛋白條帶，CPB012能夠產(chǎn)生135-140 kDa、80 kDa和70 kDa特異性條帶，而CPB016和CPB111未見上述蛋白條帶，與基因型測定結果吻合。
　　3、對柑桔小實蠅（Bactrocera dorsalis）殺蟲效果測定
　　四個菌株對雙翅目害蟲柑桔小實蠅(Bactrocera do

8、rsalis)2齡幼蟲的生測實驗表明，被感染試蟲與正常試蟲相比，逐漸停止攝食，蟲體中部先發(fā)黑，最后蟲體全身發(fā)黑腐爛。CPB008和CPB012菌株接種后7d的累計死亡率LR7d分別為70.86％和76.72％，而CPB016和CPB111組未見幼蟲死亡，蟲體順利化蛹。CPB008的LT50為3.1d，CPB012的LT50為2.4 d。CPB008的致死中濃度LC50為9.96×107 cells/mL, CPB012的致死中濃度LC5

9、0為2.03×107 cells/mL。由此判斷CPB012在4個菌株中，對雙翅目柑桔小實蠅生物毒性最高。
　　結合本實驗前期用4個菌株對鱗翅目家蠶(Bombyx mori)和鞘翅目馬鈴薯甲蟲的生物測定試驗，最終判斷它們均具有幾丁質(zhì)酶活性，當試蟲是家蠶和馬鈴薯甲蟲時，CPB008效果最好，當試蟲是柑桔小實蠅時，CPB012效果最好。這也與CPB008和CPB012具有的多個cry1類和cry2類殺蟲功能基因相符合。而CPB016和

10、CPB111對家蠶和馬鈴薯甲蟲具有一定的毒性，但是對于柑桔小實蠅不具有明顯毒殺作用，可能是兩菌株不能產(chǎn)生對雙翅目專一性的殺蟲蛋白所致。
　　綜上所述，來自于馬鈴薯甲蟲的蘇云金芽孢桿菌CBP008和CPB012菌株含有cry1類和cry2和vip3A類殺蟲功能基因，可能調(diào)控合成了135-140 kDa、80 kDa和70 kDa的相應殺蟲功能蛋白，因此對雙翅目柑桔小實蠅、鞘翅目馬鈴薯甲蟲及鱗翅目家蠶都具有很強的毒殺作用，在作物害蟲的