蘇云金芽孢桿菌Cry蛋白分離純化及其增效研究.pdf

1、東北農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文蘇云金芽孢桿菌Cry蛋白分離純化及其增效研究姓名：韓嵐嵐申請學位級別：碩士專業(yè)：昆蟲學指導教師：趙奎軍張杰2002.6.1一!i!查些查蘭堡主笙苧蔓墨童莖塑莖墮!迫墨旦坌苧絲些墨苧堡苧竺!!一如60kDa的多肽，與前人報道相符。這幾種蛋白在50raMNa2C03和20mM乙醇胺。DH：100)溶液中消化的結果相同，只是在20InlVl乙醇胺(pH=10O)溶液中消化后的得奉相對低～些。莊LB液體培養(yǎng)基中，這幾株菌

2、株的生長速率均較受體菌BL21(DE3)慢，可能由于了卦源基圍的大量表達影響了受體菌的正常生長發(fā)育。在加入誘導劑IPTG2hrs后，這幾株蒲株先后進入對數(shù)生長期，其順序為CrylCa7、co，1Cb2、CDllel、CrylIa8，最遲進入時數(shù)生長期的是Cr5r2Ab4，并分別于12、16、竦HD73是在生長4小時后進八對數(shù)生長期，16、16、20hrs進入穩(wěn)定生長期。而Bt菌12小時后進入穩(wěn)定生長期。2BtCry蛋白分離純化的研究研究

3、了Bt菌株和在Ecoli中BtCry蛋白的提取時機，先后分離純化了cD1Ca7、CnlCb2、cr、1lab、Cr、llel、Cry2Ab4蛋白和標準菌株Cr31Ac(HD一73)蛋白研究表明在Eccl，中表達的蛋白均在培養(yǎng)68hrs含量達到最高，CrylAc晶體蛋白則是在培養(yǎng)28—32hrs達到最高。將這幾種蛋白經(jīng)FPLC純化并進行了活性分析表明CrylAc在5～6ml記的；屯脫峰活性較商而在cry基因Ecoli中表達產(chǎn)物則是在1肛l

4、lml處有較高的活性。3BtCry蛋白對棉鈴蟲幼蟲毒性的研究將上述6種cr、r蛋白對棉鈴蟲進行初篩和兩兩正交組合的復篩，結果表明Cry1Ac和Cr2Ab4對棉鈴蟲的毒性較強，LC，o分別為315ug／ml和415ug／ml；CrylAcCr3’2Ab4組占的LC。為487ug／ml，兩者的共毒系數(shù)(CTC)為121，具有一定的增效作用。其余毒鬃對棉鈴蟲毒力的強弱依次是Cryllel、Crylla8、CrylCa7、CDrlCb2，這幾種

5、蛋白的蛆臺對棉鈴蟲沒有增效作用。4BtCry蛋白對玉米螟幼蟲毒性的研究將上述6種Cry蛋白對玉米螟進行初篩和兩兩正交組合的復篩，結果表明CnrlAc、(nrllag、CDlIel對玉米螟有很強的活性將這三種蛋白進行正交組合對玉米螟進行生測，發(fā)脫C01Ac與COllel、05，lIa8分別有明顯增效作用、相加作用用校正死亡率進行SAS舒析Cf)IAc、C07lla8、CO7llel、CrylAcCr5，lIel、Cry1AcCry1la8

6、的LCⅫ分別為：0134、0500、0223、O046、019Sug／g。CrylAcCr31Iel和CryIAcCr)rlla8蛋白組臺有顯著的增效作用，CTe分別為409和1(J6在LC”LC，s水平CDqAc的毒力最高。這些研究結果說明了CrylAc、Cryllel、CrylAcCr3llel以及Cr3，1AcCryllab蛋白組臺對玉米螟有很強的殺蟲活性，它們完全能取代已有的crylAb基因用于工程菌和抗蟲二程植物的構建。同時也