約氏瘧原蟲基因條件修飾體系的建立.pdf

1、目的：
　　瘧疾是瘧原蟲經(jīng)媒介按蚊傳播引起的一種在熱帶和亞熱帶地區(qū)廣泛流行的嚴(yán)重威脅人類健康的感染性寄生原蟲疾病，仍然是全球最嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題之一，給全球尤其是發(fā)展中國家?guī)砹顺林氐慕】滴：蛧?yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。并且其病原體瘧原蟲對抗瘧藥物及按蚊對殺蟲劑逐漸產(chǎn)生了抗藥性，使瘧疾的防治更加嚴(yán)峻。而通過分子生物學(xué)和免疫學(xué)等綜合基礎(chǔ)性研究，進(jìn)一步揭示瘧原蟲與感染宿主間相互作用的分子機(jī)制，將為瘧疾的防治提供理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。
　　隨

2、著瘧原蟲全基因組測序的完成，基因打靶技術(shù)成為體內(nèi)基因功能研究的重要手段。已在惡性瘧原蟲、伯氏瘧原蟲和約氏瘧原蟲等成功的應(yīng)用基因打靶技術(shù)，實現(xiàn)蛋白質(zhì)的去除和修飾，促進(jìn)了從分子水平出發(fā)的瘧原蟲研究。同時用源于酵母的Flp/FRT位點(diǎn)特異重組系統(tǒng)在伯氏瘧原蟲建立了基因條件修飾體系，通過特定階段的基因修飾以進(jìn)行基因功能的研究。
　　瘧疾感染的關(guān)鍵為含有瘧原蟲子孢子的雌性按蚊叮咬宿主時，子孢子隨蚊的唾液進(jìn)入人體，在肝細(xì)胞內(nèi)發(fā)育為成熟裂殖體后

3、，肝細(xì)胞破裂，裂殖子散出，進(jìn)入血竇，一部分裂殖子被吞噬細(xì)胞吞噬，一部分則侵入紅細(xì)胞內(nèi)發(fā)育。雖然宿主紅前期并無臨床表現(xiàn)，但瘧原蟲的紅前期是其生活史中的一個瓶頸階段，是篩選抗瘧候選疫苗抗原和預(yù)防臨床感染的藥物作用靶階段。
　　目前已在伯氏瘧原蟲建立了基因敲除體系用于紅前期基因功能的研究，如MSPl(Merozoite surface protein1)、PKG(cyclic GMP dependent protein kinase)、

4、SUBl(subtilisin-like protease1)等在瘧原蟲肝階段發(fā)育的作用?？上鄬τ诓席懺x，紅前期疫苗的研究特別是減毒子孢子活疫苗的研究主要采用約氏瘧原蟲這種鼠瘧模型，主要原因為約氏瘧原蟲具有小鼠子孢子半數(shù)感染量相對較低，獲得針對子孢子的保護(hù)性免疫較慢等更像人惡性瘧原蟲的特性。并且全基因序列比對分析發(fā)現(xiàn)約氏瘧原蟲與惡性瘧原蟲具有很高的同源性。由此可見約氏瘧原蟲亦是紅前期研究的可選鼠瘧模型，具有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。但是用于基因

5、紅前期功能研究的Flp/FRT基因條件修飾體系并未在約氏瘧原蟲建立。
　　本研究使用基因打靶單交叉法將含有Flp基因序列的載體插入到UIS4基因5'調(diào)控序列后，并通過位點(diǎn)特異的重組(SSR)去除篩選標(biāo)記，以獲取子孢子期特異性表達(dá)Flp的約氏瘧原蟲蟲株，并對其生物學(xué)特性、介導(dǎo)的SSR效率和靶基因的FRT位點(diǎn)標(biāo)記進(jìn)行分析，以期建立有效的約氏瘧原蟲基因條件修飾體系，用于研究瘧原蟲基因在紅前期的功能，并嘗試用于基因工程減毒活疫苗研究。

6、r>　　方法：
　　一、獲取UIS4和EBL基因相關(guān)生物學(xué)信息，設(shè)計打靶載體構(gòu)建引物及瘧原蟲基因型鑒定引物
　　在PlasmoDB數(shù)據(jù)庫獲取約氏瘧原蟲UIS4和EBL基因的序列信息;使用在線引物設(shè)計軟件primer-BLAST設(shè)計打靶載體構(gòu)建所用引物及瘧原蟲基因型鑒定引物。
　　二、P.yoelii17XL基因組DNA的提取
　　小鼠感染瘧原蟲至瘧疾血癥到50％時，心臟采血，提取瘧原蟲基因組DNA。
　　三

7、、打靶載體pyUlS4/Flp、pDCO-F3-EBL、pDCO-EBL5U、pCHD-EBL-F3、pDCO-F3-EBL-mGFP和pSCO-F3-EBL-eGFP的構(gòu)建
　　使用分子克隆的方法，即目的堿基序列的獲取、酶切、連接等步驟構(gòu)建打靶載體pyUIS4/Flp、pDCO-F3-EBL、pDCO-EBL5U、pDCO-F3-EBL-mGFP和pSCO-F3-EBL-eGFP。使用Multisite gateway的技術(shù)構(gòu)建

8、打靶載體pCHD-EBL-F3，并對Multisite gateway的克隆技術(shù)與傳統(tǒng)的分子克隆方法進(jìn)行比較。
　　四、基因條件敲除蟲株P(guān).yUIS4/Flp的構(gòu)建
　　（一）線性化打靶載體的制備
　　進(jìn)行質(zhì)粒pyUIS4/Flp的大量抽提，并使用限制性內(nèi)切酶NheⅠ酶切過夜，進(jìn)行線性化，再使用苯酚:氯仿:異戊醇抽提法純化線性化質(zhì)粒。
　?。ǘ?瘧原蟲體外培養(yǎng)及裂殖體純化
　　瘧原蟲感染小鼠至瘧疾血癥20％

9、時，心臟采血，抗凝，體外培養(yǎng)過夜，次日梯度密度離心提取成熟裂殖體。
　?。ㄈ┋懺x電轉(zhuǎn)染
　　使用Amaxa nucleofector技術(shù)進(jìn)行瘧原蟲裂殖體電轉(zhuǎn)染。
　　（四）瘧原蟲的篩選、克隆及基因型的鑒定
　　使用乙胺嘧啶飲水，進(jìn)行約氏瘧原蟲轉(zhuǎn)化子的藥物篩選;對抗性瘧原蟲PCR鑒定;使用有限稀釋法對PCR鑒定含有重組瘧原蟲的鼠瘧血進(jìn)行克隆;提取所獲瘧原蟲克隆基因組進(jìn)行PCR和Southern blot分析。<

10、br>　?。ㄎ澹┧幬锖Y選基因的刪除及基因型鑒定
　　蚊叮咬基因型鑒定正確的重組瘧原蟲克隆感染第3天的小鼠，使瘧原蟲進(jìn)入蚊體內(nèi)發(fā)育。蚊吸血后14天再叮咬健康小鼠以獲藥物篩選基因切除瘧原蟲蟲株并應(yīng)用PCR和Southern blot進(jìn)行基因型鑒定。
　?。㏒SR效率分析
　　分別提取蚊吸血后第10天和第14天唾液腺子孢子感染的鼠瘧血基因組，PCR擴(kuò)增FRT位點(diǎn)標(biāo)記的藥物篩選基因區(qū)段，1％的瓊脂糖凝膠電泳后比較SSR效率

11、。
　　(七）瘧原蟲p.yUIS4/Flp的表型分析
　　制備涂片，Giemsa染色，顯微鏡下觀察比較瘧原蟲P.yUIS4/Flp和野生型的形態(tài)。自尾靜脈注射子孢子/蚊叮咬感染后第3天開始每天經(jīng)小鼠尾靜脈采血，制備薄血膜，Giemsa染色，鏡檢計數(shù)紅細(xì)胞感染率，統(tǒng)計小鼠生存率。至第14天，外周血涂片無感染的紅細(xì)胞則認(rèn)為未感染。
　　五、針對EBL基因的FRT位點(diǎn)的標(biāo)記分析
　　同實驗方法四（一）、（二）、（三），

12、分別用線性化的質(zhì)粒pDCO-EBL5U、pDCO-F3-EBL-mGFP和pSCO-F3-EBL-eGFP進(jìn)行瘧原蟲p.yUIS4/Flp的電轉(zhuǎn)染，乙胺嘧啶篩選瘧原蟲轉(zhuǎn)化子，使用PCR并結(jié)合測序分析FRT標(biāo)記問題。
　　六、統(tǒng)計分析
　　應(yīng)用GraphPad Prism5.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，瘧疾血癥的組間比較采用Student's t檢驗，生存曲線分析采用log-rank(mantel-cox)分析，P＜0.

13、05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　一、打靶載體的構(gòu)建
　　使用PlasmoDB網(wǎng)站獲取的基因相關(guān)信息，通過在線軟件primer-BLAST設(shè)計出打靶載體構(gòu)建引物，使用引物分別PCR擴(kuò)增出了所需堿基序列，并使用分子克隆的方法構(gòu)建出打靶載體pDCO-EBL5U、pDCO-F3-EBL-mGFP和pSCO-F3-EBL-eGFP，酶切鑒定正確，測序結(jié)果表明符合打靶要求。
　　二、載體構(gòu)建方法Multisite

14、 gateway克隆技術(shù)與傳統(tǒng)分子克隆方法的比較
　　通過分子克隆的方法構(gòu)建出打靶載體pDCO-F3-EBL，并使用Multisitegateway克隆方法構(gòu)建出具有相同功能的打靶載體pCHD-EBL-F3。對兩種構(gòu)建方法比較發(fā)現(xiàn):即使瘧原蟲的基因組含有較多的AT序列，Multisite gateway克隆方法也能較快捷的構(gòu)建出打靶載體。
　　三、用于基因條件修飾瘧原蟲蟲株P(guān).yUIS4/Flp的構(gòu)建
　　使用Amax

15、a nucleofector技術(shù)成功的實現(xiàn)了約氏瘧原蟲裂殖體的電轉(zhuǎn)染并篩選出重組瘧原蟲，通過有限稀釋法獲取了重組瘧原蟲克隆P.yUIS4/Flp(R)。瘧原蟲P.yUIS4/Flp(R)進(jìn)入蚊體內(nèi)在子孢子期通過Flp酶介導(dǎo)的SSR切除藥物篩選基因表達(dá)盒，并發(fā)現(xiàn)相對于蚊感染后10天的子孢子，第14天的子孢子能介導(dǎo)產(chǎn)生較完全的SSR。通過P.yUIS4/Flp(R)感染的蚊再次叮咬健康小鼠成功的獲取無藥物篩選基因的瘧原蟲蟲株P(guān).yUIS4/

16、Flp，對其進(jìn)行表型分析發(fā)現(xiàn)瘧原蟲P.yUIS4/Flp在生活史發(fā)育和感染性方面與野生型瘧原蟲并無顯著差別。
　　結(jié)論：
　　1.成功的構(gòu)建打靶載體pyUIS4/Flp、pDCO-EBL5U、pDCO-F3-EBL-mGFP、pSCO-F3-EBL-eGFP和pCHD-EBL-F3。
　　2.將Multisite gateway克隆技術(shù)成功的應(yīng)用于瘧原蟲條件性基因打靶載體的構(gòu)建，使條件性基因打靶載體的構(gòu)建更加簡便快捷。