約氏瘧原蟲BY265株減毒子孢子誘導(dǎo)小鼠保護性免疫的研究.pdf

1、瘧疾仍然是世界上嚴重危害人類健康的傳染病。全球大約有40％的人口面臨感染瘧疾的危險,每年大約有1～3億的新發(fā)瘧疾病例,其中死亡人數(shù)在100～200萬左右。瘧疾是由按蚊的叮咬傳播的。按蚊叮刺時將瘧原蟲子孢子注入宿主體內(nèi),隨后子孢子進入血液循環(huán),并可在數(shù)分鐘后迅速侵入肝細胞。經(jīng)短暫的紅外期增殖發(fā)育,裂殖子再次進入血液循環(huán)、侵入紅細胞導(dǎo)致瘧疾臨床發(fā)作。
　　 疫苗是瘧疾防治的重要手段之一。雖然,瘧原蟲紅外期感染不會引起患者出現(xiàn)臨床表現(xiàn)

2、,但是,阻斷紅外期瘧原蟲的發(fā)育可以防止紅內(nèi)期瘧原蟲的發(fā)育;另外,紅外期休眠子的存在也是間日瘧原蟲患者復(fù)發(fā)的重要原因,因此,瘧原蟲紅外期能從源頭控制瘧原蟲的感染和防止瘧疾的復(fù)發(fā),是設(shè)計瘧疾亞單位疫苗的理想時期。
　　 迄今為止,最有保護性的紅外期疫苗是減毒子孢子疫苗,它能為宿主提供相對持久的保護性免疫。由于子孢子需要在蚊體內(nèi)發(fā)育,而且子孢子的減毒的程度不易控制,因此限制了減毒子孢子疫苗在實際中的應(yīng)用。然而,鑒于減毒子孢子疫苗能誘發(fā)

3、持久的保護性免疫,因此被作為研究有效肝期疫苗和篩選疫苗及候選抗原的重要模型。本研究建立了約氏瘧原蟲265株減毒子孢子疫苗誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生完全保護性免疫小鼠模型,并初步探討了減毒子孢子疫苗的保護性效應(yīng)機制,為深入研究紅外期疫苗的保護性免疫機制和瘧疾亞單位疫苗的研制奠定了重要的基礎(chǔ)。
　　 一、構(gòu)建Real-time PCR紅外期瘧原蟲檢測平臺:比對已知不同種屬瘧原蟲的A型18S rRNA的核苷酸序列,根據(jù)保守核苷酸序列設(shè)計瘧原蟲特異的

4、18S rRNA引物,PCR擴增獲得長度約為839bp的目的片段。常規(guī)T/A克隆獲得P.y.BY265株18S rRNA序列,與約氏瘧原蟲17XNL株相似性為98％。根據(jù)P.y.BY265株18S rRNA序列設(shè)計特異Real-time PCR引物和TaqMan探針,以小鼠GAPDH為內(nèi)參照,構(gòu)建P.y.BY265紅外期瘧原蟲Real-time PCR檢測平臺,結(jié)果顯示,構(gòu)建的Real-time PCR檢測平臺能夠檢測到最低為50個子孢

5、子劑量感染的小鼠肝臟蟲荷。
　　 二、減毒子孢子誘導(dǎo)免疫小鼠產(chǎn)生保護性免疫及其效應(yīng)機制:
　　 1、確定減毒子孢子輻照減毒最適合的劑量:采用8000rd和10000rd劑量的60Co室溫照射減毒約氏瘧原蟲BY265株子孢子80 min后,以10000個/次尾靜脈注入小鼠,部分小鼠在瘧原蟲感染后42h取出肝臟進行Real-time PCR分析,部分小鼠在瘧原蟲感染后4～14天內(nèi)進行原蟲血癥檢查。結(jié)果顯示,8000rd輻照組

6、感染小鼠能檢測到瘧原蟲特異的18sUrRNA,而10000rd輻照組感染小鼠未能檢測到瘧原蟲特異的18sUrRNA:一直到感染后14天,兩組感染小鼠均未檢測到紅內(nèi)期瘧原蟲,因此,8,000rd應(yīng)該是比較合適的子孢子減毒輻照劑量。
　　 2、減毒子孢子免疫誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生完全保護性免疫:末次免疫后14天,尾靜脈注射1,000個野生株子孢子攻擊感染減毒子孢子免疫小鼠和對照小鼠,攻擊后5～14天,吉氏染色常規(guī)檢測瘧原蟲紅內(nèi)期,發(fā)現(xiàn)正常對照

7、組小鼠在第5天出現(xiàn)原蟲血癥,第14天時原蟲血癥達到10％以上;然而,減毒子孢子免疫小鼠在攻擊后14天均未查見紅內(nèi)期瘧原蟲,說明減毒子孢子免疫能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生完全保護性免疫。
　　 3、減毒子孢子免疫的保護性效應(yīng)機制的初探:末次免疫后30天,收集對照組小鼠和減毒子孢子免疫小鼠血清,采用間接免疫熒光實驗檢測血清中抗子孢子特異抗體的滴度。結(jié)果顯示,2只減毒子孢子免疫小鼠血清的抗子孢子抗體滴度分別為1:200和1:400:然而,正常對照組

8、小鼠血清在1:10稀釋度時無任何熒光反應(yīng),而減毒子孢子免疫小鼠血清均可與約氏瘧原蟲BY265株子孢子發(fā)生特異熒光結(jié)合反應(yīng),且熒光點數(shù)量、亮度隨血清稀釋度增加而減少,提示減毒子孢子疫苗能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生子孢子特異抗體。
　　 末次免疫后45天,分離對照組和減毒子孢子免疫小鼠的肝臟淋巴細胞,CSP CD8+T細胞表位多肽SYVPSAEQ刺激18h后,檢測IFNI-γ的分泌情況,發(fā)現(xiàn)CSP CD8+T細胞表位多肽能有效的刺激免疫小鼠肝臟淋