約氏瘧原蟲(chóng)藥物減毒子孢子疫苗誘導(dǎo)蟲(chóng)期特異性免疫保護(hù)作用機(jī)制的研究.pdf

1、瘧疾是全球危害最為嚴(yán)重的三大傳染病之一?？汞懰幠退幮缘娜遮厙?yán)重以及其他有限的瘧疾防止措施使瘧疾疫苗的研制工作變得更為迫切。紅前期是瘧原蟲(chóng)感染人體的第一個(gè)時(shí)期，而且紅前期并不引起明顯的臨床癥狀，因而，紅前期是瘧疾疫苗研制最為理想的時(shí)期。瘧原蟲(chóng)減毒子孢子疫苗可以誘導(dǎo)針對(duì)瘧疾紅前期的完全免疫保護(hù)。放射減毒子孢子(Radiation-attenuated sporozoite，RAS)的相關(guān)研究顯示，感染瘧原蟲(chóng)的按蚊經(jīng)過(guò)放射減毒處理后通過(guò)叮咬的

2、方式免疫人體，大約1000個(gè)按蚊的叮咬可以誘導(dǎo)人體對(duì)瘧原蟲(chóng)感染的完全保護(hù)作用。同時(shí)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，基于氯喹和其它抗瘧藥治療的藥物減毒子孢子疫苗(infection-treatment-vaccination，ITV)也能夠誘導(dǎo)小鼠或者人群對(duì)子孢子(sporozoite，SPZ)攻擊的完全保護(hù)，而且ITV的免疫方式所需要的SPZ量比RAS更少。有研究發(fā)現(xiàn)，基于氯喹(chloroquine，CQ)的ITV在通過(guò)15個(gè)感染按蚊的3次叮咬后可以介導(dǎo)人

3、體對(duì)瘧原蟲(chóng)感染的完全保護(hù)作用。這說(shuō)明ITV的免疫方式和RAS相比具有更強(qiáng)的抗原性。然而，目前ITV疫苗研究中所使用的大部分藥物如氯喹等因?yàn)槿蚍秶目顾幮约案弊饔么蟮热秉c(diǎn)阻礙了其應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)的可能。青蒿素聯(lián)合療法是目前治療瘧疾的一線(xiàn)用藥，青蒿素能更為迅速而且可以殺滅紅內(nèi)期瘧原蟲(chóng)的各個(gè)時(shí)期，雖然近幾年關(guān)于青蒿素耐藥性的報(bào)道逐漸增多，但是目前并無(wú)對(duì)青蒿素的完全耐藥即并無(wú)抗性株被分離鑒定。青蒿素及其衍生物與氯喹相似，均為通過(guò)殺死紅內(nèi)期瘧原蟲(chóng)來(lái)控

4、制瘧疾的癥狀，但是青蒿素及其衍生物與氯喹的殺蟲(chóng)作用又有不盡相同之處:氯喹僅能殺傷滋養(yǎng)體期以后時(shí)期的瘧原蟲(chóng)，而青蒿素及其衍生物卻可以殺傷全部紅內(nèi)期的瘧原蟲(chóng)，包括早期的環(huán)狀體。本研究首先驗(yàn)證了青蒿素衍生物青蒿琥酯(artesunate，AS)作為ITV候選藥物的可能，然后比較氯喹及青蒿琥酯ITV兩種免疫方式所介導(dǎo)的免疫保護(hù)性的差異，深入研究了造成兩種藥物免疫保護(hù)差異性的機(jī)制。
　　本項(xiàng)目利用約氏瘧原蟲(chóng)/小鼠感染模型，通過(guò)尾靜脈接種SP

5、Z后給予青蒿琥酯或者氯喹控制紅內(nèi)期瘧原蟲(chóng)的感染，免疫后給予SPZ或者感染紅細(xì)胞攻擊，驗(yàn)證其保護(hù)性。發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯組小鼠僅對(duì)SPZ的攻擊有免疫，而氯喹組小鼠對(duì)SPZ及紅內(nèi)期的攻擊均有免疫。然后，我們研究了青蒿琥酯及氯喹兩種不同藥物處理因素誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫保護(hù)差異性的機(jī)制。利用ELISA和IFA試驗(yàn)比較兩組小鼠抗體的差異性，并通過(guò)血清過(guò)繼轉(zhuǎn)移試驗(yàn)及體外子孢子入侵試驗(yàn)從功能上驗(yàn)證血清在免疫保護(hù)性中發(fā)揮的作用。最后利用流式細(xì)胞分析技術(shù)檢測(cè)了肝臟及脾臟

6、淋巴細(xì)胞表型在免疫過(guò)程中的表達(dá)變化，并通過(guò)體外肝期瘧原蟲(chóng)發(fā)育抑制試驗(yàn)證實(shí)CD8+T細(xì)胞在紅前期保護(hù)性中的作用。具體的研究結(jié)果如下:
　　1、在第一次免疫過(guò)程中，氯喹組小鼠在給藥期間第4、5天出現(xiàn)可見(jiàn)的原蟲(chóng)血癥，但是原蟲(chóng)血癥比例在1％以下，第6天原蟲(chóng)血癥消失。但是在停藥第4天后，原蟲(chóng)血癥再次出現(xiàn)，并且提高CQ的給藥劑量，該現(xiàn)象仍然存在。但是高劑量的青蒿琥酯組卻能完全殺滅紅內(nèi)期的感染。第一次免疫后11，14，18和24天通過(guò)RT-qP

7、CR檢測(cè)瘧原蟲(chóng)18SrRNA的結(jié)果與血涂片檢測(cè)的結(jié)果相吻合。第二次免疫和第三免疫時(shí)氯喹組和青蒿琥酯組均未出現(xiàn)原蟲(chóng)血癥，經(jīng)過(guò)3次免疫后，兩組小鼠均能產(chǎn)生針對(duì)約氏瘧原蟲(chóng)SPZ攻擊的100％的免疫保護(hù)性，并且該保護(hù)性能持續(xù)至少6個(gè)月。而且，氯喹組不僅能夠誘發(fā)小鼠產(chǎn)生紅前期特異的保護(hù)作用，而且也能誘導(dǎo)一定的紅內(nèi)期的保護(hù)作用，61.5％的小鼠在感染紅細(xì)胞攻擊后未出現(xiàn)原蟲(chóng)血癥。但是，青蒿琥酯組小鼠僅對(duì)SPZ的攻擊有保護(hù)性。該現(xiàn)象說(shuō)明青蒿琥酯組小鼠所

8、介導(dǎo)的保護(hù)性是紅前期特異的，而氯喹組小鼠不僅產(chǎn)生了對(duì)紅前期的免疫保護(hù)，對(duì)紅內(nèi)期也產(chǎn)生了一定的免疫保護(hù)作用。
　　2、氯喹組及青蒿琥酯組小鼠抗紅內(nèi)期特異抗體的表達(dá)存在很大的差異。IFA及ELISA的實(shí)驗(yàn)證明青蒿琥酯組小鼠并未產(chǎn)生抗紅內(nèi)期的抗體，而氯喹組不僅產(chǎn)生了紅內(nèi)期特異的抗體，并且低劑量紅內(nèi)期感染所介導(dǎo)的抗體反應(yīng)足以對(duì)紅內(nèi)期瘧原蟲(chóng)起到殺傷作用。這就說(shuō)明抗體在兩組免疫小鼠的保護(hù)性差異中發(fā)揮了重要的作用。
　　3、氯喹組及青蒿琥

9、酯組小鼠在免疫期間均表現(xiàn)出相似的肝臟CD8+Tem細(xì)胞的增殖，并且隨著免疫次數(shù)的增加而增加。在3次免疫后，青蒿琥酯組小鼠CD8+Tem細(xì)胞的比例與第一次免疫后相比約增加了1.8倍，氯喹組小鼠CD8+Tem細(xì)胞的比例與第一次免疫后相比約增加了1.4倍。同時(shí)CSP特異的CD8+Tem細(xì)胞的表達(dá)在攻擊前后增加了2.4-3.7倍，但是氯喹組和青蒿琥酯組之間并無(wú)明顯差異。說(shuō)明CD8+Tem細(xì)胞在ITV免疫小鼠的紅前期免疫保護(hù)中發(fā)揮了重要的作用，但

10、是并不是介導(dǎo)兩組小鼠保護(hù)性差異的主要因素。
　　4、我們構(gòu)建了體外實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，能夠定量的檢測(cè)CD8+T細(xì)胞對(duì)感染肝細(xì)胞的殺傷性的效應(yīng)。在與500k CD8+T細(xì)胞共培養(yǎng)后，蚊唾液腺免疫對(duì)照組檢測(cè)到約34.9％的非特異性抑制作用，但是氯喹組及青蒿琥酯組均表現(xiàn)出大于80％的抑制作用。該平臺(tái)可以定量評(píng)價(jià)CD8+T細(xì)胞的功能，為以后高通量CD8+T細(xì)胞的功能研究提供重要的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。
　　我們的研究結(jié)果證實(shí)了青蒿琥酯可以作為ITV免疫模

11、型的治療藥物，青蒿琥酯對(duì)紅內(nèi)期瘧原蟲(chóng)的殺傷性與瘧原蟲(chóng)攻擊的數(shù)量及藥物的劑量相關(guān)，說(shuō)明青蒿琥酯誘導(dǎo)的瘧原蟲(chóng)期特異性的保護(hù)是藥物劑量依賴(lài)的。我們首次通過(guò)試驗(yàn)證實(shí)氯喹治療的藥物減毒子孢子疫苗所介導(dǎo)的免疫保護(hù)性并不是紅前期特異的，免疫過(guò)程中低劑量的紅內(nèi)期感染介導(dǎo)了其產(chǎn)生紅內(nèi)期特異的免疫保護(hù)。兩種藥物ITV介導(dǎo)的免疫保護(hù)均是由抗體和T細(xì)胞所共同介導(dǎo)的，CD8+Tem是介導(dǎo)紅前期免疫保護(hù)作用的關(guān)鍵因素，而抗體也在這個(gè)過(guò)程中發(fā)揮了一定的作用?？贵w是介