隱孢子蟲特異性人源抗體Fab片段的制備和研究.pdf

1、隱孢子蟲屬于頂復(fù)門胞內(nèi)寄生機(jī)會(huì)致病性原蟲，可感染人和多種動(dòng)物，引起以腹瀉為主要癥狀的隱孢子蟲病，是危害全球的公共衛(wèi)生問(wèn)題，至今仍無(wú)有效的控制和治療手段。大量研究表明，高滴度牛初乳(HBC)、高滴度牛初乳免疫球蛋白(HBCIg)、一系列針對(duì)隱孢子蟲表面致病相關(guān)蛋白的特異性多克隆抗體及鼠源單克隆抗體等均可在動(dòng)物或人體內(nèi)產(chǎn)生抗隱孢子蟲作用，證明了被動(dòng)免疫治療隱孢子蟲感染的有效性，故本研究擬進(jìn)一步研制隱孢子蟲特異性人源抗體。 首先從奶牛

2、糞便中分離、鑒定、純化獲得微小隱孢子蟲卵囊，感染SCID小鼠保種；以微小隱孢子蟲卵囊免疫志愿者，獲得含有較高滴度抗微小隱孢子蟲IgG抗體的外周血，從中分離淋巴細(xì)胞，利用工程抗體技術(shù)構(gòu)建非依賴性克隆滴度為8×106的人抗隱孢子蟲免疫球蛋白G基因文庫(kù)；選擇位于隱孢子蟲胞外發(fā)育階段蟲體表面和頂端、直接參與蟲體對(duì)宿主細(xì)胞的吸附和入侵過(guò)程的糖蛋白gp40／15作為抗體庫(kù)篩選的抗原靶的，應(yīng)用DNA重組技術(shù)將擴(kuò)增得到的Cpgp40／15基因克隆入原核

3、表達(dá)載體pETl9b中，轉(zhuǎn)化宿主菌、誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白，純化得到可被含有抗微小隱孢子蟲特異性抗體的血清識(shí)別、具有特異免疫原性的重組抗原gp40／15，每100mi培養(yǎng)菌液中可獲得高純度重組蛋白3．6mg；采用克隆印跡法和ELISA對(duì)抗體庫(kù)進(jìn)行多輪篩選，共篩選克隆數(shù)約為1．01×106個(gè)，經(jīng)ELISA、IFA等方法反復(fù)驗(yàn)證，最終獲得兩個(gè)陽(yáng)性克隆，分別命名為Agp40—1和Agp40—2；Agp40．1的輕鏈可變區(qū)近似系為A20，基因同源性為

4、95％；重鏈可變區(qū)近似系為VH3-30，基因同源性為92％；Agp40-2的輕鏈可變區(qū)近似系為012，基因同源性為97％；重鏈可變區(qū)近似系為VH3-30，基因同源性為92％；分別對(duì)兩個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行大量表達(dá)，并以金屬螯合親和層析法進(jìn)行純化，得到重輕鏈結(jié)構(gòu)完整、純度較高的抗體Fab片段，得量為1mg/L培養(yǎng)液；經(jīng)ELSIA、斑點(diǎn)印跡、免疫印跡、IFA等檢測(cè)證實(shí)兩個(gè)純化Fab片段均可特異性識(shí)別天然及重組微小隱孢子蟲表面抗原；Biacore檢測(cè)