抗IL-33人源性單鏈抗體的制備及特異性分析.pdf

1、目的：IL-33是在2005年發(fā)現的一種前炎癥細胞因子,是IL-1家族成員,同時也是可調控基因轉錄的核因子。它作為ST2受體的特異性配體,通過結合到ST2和IL-1受體輔助蛋白組成的二聚體,募集髓樣細胞分化反應蛋白88(MYD88),激活磷脂酶(PLD)-鞘氨醇激酶(SpHK)通路和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路,促進Th2型免疫應答的發(fā)生。在臨床上,IL-33與感染性疾病,炎性疾病,過敏性反應,心血管疾病,中樞系統(tǒng)疾病,疼痛,關節(jié)

2、炎等疾病密切相關。本研究的目的是制備并鑒定高親和力的抗IL-33全人源性單鏈抗體,用以后續(xù)進行的抗IL-33全人源抗體與自身免疫性疾病的臨床研究。
　　方法：本研究前期以健康人外周血淋巴細胞構建了文庫容量為108的天然全人源抗體文庫,從天然抗體文庫中采用噬菌體展示技術篩選了抗IL-33全人源單鏈抗體。為提高單鏈抗體的親和力,采用易錯PCR隨機突變和DNA改組技術針對篩選的抗IL-33單鏈抗體建立了抗IL-33單鏈抗體突變文庫。本研

3、究在前期工作的基礎上,進行了以下工作:①表達純化人IL-33蛋白。將構建的IL-33/PET102/D-TOPO質粒轉化到大腸桿菌BL21Cacl2感受態(tài)中,包涵體表達后Ni-NTA樹脂純化,濃縮柱濃縮后,進行SDS-PGE電泳和Westernblot驗證。②表達純化了從天然抗體文庫中篩選的抗IL-33單鏈抗體。將從天然抗體文庫中篩選的抗IL-33單鏈抗體基因轉化入大腸桿菌DH5aF’Cacl2感受態(tài)中,經過PCR檢測陽性克隆子后,進行

4、了經IPTG誘導包涵體表達,Ni-NTA樹脂純化,SDS-PGE電泳和Westernblot驗證。③對抗IL-33單鏈抗體突變文庫采用噬菌體展示技術進行了3輪富集并進行了單鏈抗體篩選。以生物素化的可溶性細胞因子IL-33為抗原,采用鏈霉素標記的M280磁珠為篩選載體對突變抗體文庫進行了3輪富集,從第3輪篩選后的抗體文庫中隨機挑取單克隆子進行了小量表達及ELISA鑒定,篩選抗IL-33突變全人源單鏈抗體。對篩選到的陽性克隆子進行PCR鑒定

5、和Westernblot驗證。
　　結果：①測序IL-33/PET102/D-TOPO質粒,結果顯示插入的外源基因為人全長IL-33cDNA;表達的IL-33融合蛋白分子量為45kDa左右;Westernblot鑒定結果顯示表達的蛋白為人IL-33蛋白。②對從天然抗體文庫中篩選的抗IL-33單鏈抗體進行測序結果顯示,序列大小為750bp左右,為開放閱讀框,各序列之間有個別氨基酸的差異,說明為不同的單鏈抗體。將抗IL-33進行了表達

6、及鑒定,ELISA結果顯示抗IL-33單鏈抗體與IL-33有很強的結合能力,而與脫脂奶粉、BSA等無關蛋白沒有任何結合反應發(fā)生。Westernblot鑒定結果顯示表達的抗IL-33單鏈抗體正確。③從突變后的抗IL-33單鏈抗體突變文庫中通過噬菌體展示技術篩選到5株陽性人源性抗IL-33單鏈抗體。后續(xù)將繼續(xù)從突變抗體文庫中篩選更多高親和力陽性克隆子,分析突變前后的單鏈抗體特異性及體外生物學功能,以得到高親和力、穩(wěn)定性好的功能性抗IL-33