抗IL-33人源性單鏈抗體的制備及特異性分析.pdf

1、目的：IL-33是在2005年發(fā)現(xiàn)的一種前炎癥細(xì)胞因子,是IL-1家族成員,同時(shí)也是可調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的核因子。它作為ST2受體的特異性配體,通過結(jié)合到ST2和IL-1受體輔助蛋白組成的二聚體,募集髓樣細(xì)胞分化反應(yīng)蛋白88(MYD88),激活磷脂酶(PLD)-鞘氨醇激酶(SpHK)通路和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路,促進(jìn)Th2型免疫應(yīng)答的發(fā)生。在臨床上,IL-33與感染性疾病,炎性疾病,過敏性反應(yīng),心血管疾病,中樞系統(tǒng)疾病,疼痛,關(guān)節(jié)

2、炎等疾病密切相關(guān)。本研究的目的是制備并鑒定高親和力的抗IL-33全人源性單鏈抗體,用以后續(xù)進(jìn)行的抗IL-33全人源抗體與自身免疫性疾病的臨床研究。
　　方法：本研究前期以健康人外周血淋巴細(xì)胞構(gòu)建了文庫(kù)容量為108的天然全人源抗體文庫(kù),從天然抗體文庫(kù)中采用噬菌體展示技術(shù)篩選了抗IL-33全人源單鏈抗體。為提高單鏈抗體的親和力,采用易錯(cuò)PCR隨機(jī)突變和DNA改組技術(shù)針對(duì)篩選的抗IL-33單鏈抗體建立了抗IL-33單鏈抗體突變文庫(kù)。本研

3、究在前期工作的基礎(chǔ)上,進(jìn)行了以下工作:①表達(dá)純化人IL-33蛋白。將構(gòu)建的IL-33/PET102/D-TOPO質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21Cacl2感受態(tài)中,包涵體表達(dá)后Ni-NTA樹脂純化,濃縮柱濃縮后,進(jìn)行SDS-PGE電泳和Westernblot驗(yàn)證。②表達(dá)純化了從天然抗體文庫(kù)中篩選的抗IL-33單鏈抗體。將從天然抗體文庫(kù)中篩選的抗IL-33單鏈抗體基因轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5aF’Cacl2感受態(tài)中,經(jīng)過PCR檢測(cè)陽(yáng)性克隆子后,進(jìn)行

4、了經(jīng)IPTG誘導(dǎo)包涵體表達(dá),Ni-NTA樹脂純化,SDS-PGE電泳和Westernblot驗(yàn)證。③對(duì)抗IL-33單鏈抗體突變文庫(kù)采用噬菌體展示技術(shù)進(jìn)行了3輪富集并進(jìn)行了單鏈抗體篩選。以生物素化的可溶性細(xì)胞因子IL-33為抗原,采用鏈霉素標(biāo)記的M280磁珠為篩選載體對(duì)突變抗體文庫(kù)進(jìn)行了3輪富集,從第3輪篩選后的抗體文庫(kù)中隨機(jī)挑取單克隆子進(jìn)行了小量表達(dá)及ELISA鑒定,篩選抗IL-33突變?nèi)嗽磫捂溈贵w。對(duì)篩選到的陽(yáng)性克隆子進(jìn)行PCR鑒定

5、和Westernblot驗(yàn)證。
　　結(jié)果：①測(cè)序IL-33/PET102/D-TOPO質(zhì)粒,結(jié)果顯示插入的外源基因?yàn)槿巳L(zhǎng)IL-33cDNA;表達(dá)的IL-33融合蛋白分子量為45kDa左右;Westernblot鑒定結(jié)果顯示表達(dá)的蛋白為人IL-33蛋白。②對(duì)從天然抗體文庫(kù)中篩選的抗IL-33單鏈抗體進(jìn)行測(cè)序結(jié)果顯示,序列大小為750bp左右,為開放閱讀框,各序列之間有個(gè)別氨基酸的差異,說明為不同的單鏈抗體。將抗IL-33進(jìn)行了表達(dá)

6、及鑒定,ELISA結(jié)果顯示抗IL-33單鏈抗體與IL-33有很強(qiáng)的結(jié)合能力,而與脫脂奶粉、BSA等無關(guān)蛋白沒有任何結(jié)合反應(yīng)發(fā)生。Westernblot鑒定結(jié)果顯示表達(dá)的抗IL-33單鏈抗體正確。③從突變后的抗IL-33單鏈抗體突變文庫(kù)中通過噬菌體展示技術(shù)篩選到5株陽(yáng)性人源性抗IL-33單鏈抗體。后續(xù)將繼續(xù)從突變抗體文庫(kù)中篩選更多高親和力陽(yáng)性克隆子,分析突變前后的單鏈抗體特異性及體外生物學(xué)功能,以得到高親和力、穩(wěn)定性好的功能性抗IL-33