雙特異性抗體與抗體融合蛋白

1、雙特異性抗體,2,雙特異性抗體,概述構(gòu)建策略應(yīng)用,3,概述,雙特異性抗體：抗體兩個(gè)結(jié)合點(diǎn)表現(xiàn)為不同的特異性，即分別結(jié)合不同表位。如，一個(gè)結(jié)合靶細(xì)胞（如腫瘤細(xì)胞），另一結(jié)合藥物或免疫效應(yīng)細(xì)胞（如蓖麻毒素、抗癌藥物、細(xì)胞毒性細(xì)胞）,4,雙特異性抗體,5,,6,雙特異性抗體的功用：提高療效，減少副作用。主要用于靶向治療。,7,構(gòu)建策略,雙特異性抗體的靶標(biāo) 一個(gè)結(jié)合治療靶標(biāo)，另一個(gè)指向體內(nèi)效應(yīng)細(xì)胞T細(xì)胞 TCR

2、CD3 CD2,8,構(gòu)建策略,雙特異性抗體的靶標(biāo) 一個(gè)結(jié)合治療靶標(biāo)，另一個(gè)指向體內(nèi)效應(yīng)細(xì)胞吞噬細(xì)胞/APC FcγR、CR,9,構(gòu)建策略,雙特異性抗體的靶標(biāo) 一個(gè)結(jié)合治療靶標(biāo)，另一個(gè)指向體內(nèi)效應(yīng)細(xì)胞NK細(xì)胞 FcγR、CD56,10,雙特異性抗體的效應(yīng)靶,11,構(gòu)建策略,雙特異性抗體的構(gòu)建方法雜化雜交瘤技術(shù) 將具有某種特異性（如抗瘤細(xì)胞）的McAb細(xì)胞株與具有抗第二抗原（如蓖麻毒蛋白）

3、的小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行融合，即產(chǎn)生出雜化雜交瘤細(xì)胞株的二價(jià)瘤體。,12,雜化雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生的雙特異性抗體,13,雜化雜交瘤分泌的抗體形式 保持原特異性抗體分子： L1H1-H1L1，L2H2-H2L2 重鏈特異性相同的配對(duì)抗體分子： L1H1-H1L2，L1H2-H2L1 L2H1-H1L2，L1H2-H2L2 重鏈、輕鏈特異性不同的配對(duì)抗體分子： L1H1-H2L2，L1H2-H1L

4、2 L1H1-H2L1，L2H2-H1L2,14,只有L1H1-H2L2才是所需的雙特異性抗體,15,雜化雜交瘤方法的不足 產(chǎn)量低，僅占10% 產(chǎn)物需篩選，費(fèi)時(shí)費(fèi)力 瘤株不穩(wěn)定,16,構(gòu)建策略,雙特異性抗體的構(gòu)建方法化學(xué)交聯(lián)法 Nisonoff和Rivers最早開始研究 化學(xué)交聯(lián)無(wú)需經(jīng)過細(xì)胞融合，比較簡(jiǎn)便易行。 通常利用重鏈與輕鏈這間的二硫鏈經(jīng)還原和再氧化，將兩種不同特異性抗體的半分子結(jié)合

5、在一起。或用雙功能交聯(lián)劑，如鄰苯酸酯等，把兩個(gè)抗體半分子交聯(lián)在一起。,17,化學(xué)交聯(lián)的雙特異性抗體,18,構(gòu)建策略,雙特異性抗體的構(gòu)建方法化學(xué)交聯(lián)法 用于制備雙功能抗體的McAb可以是完整分子，也可是經(jīng)胃酶水解獲得F（abˊ）2片段。后者在減少鼠源免疫原性方面，效果較好。,19,構(gòu)建策略,雙特異性抗體的構(gòu)建方法基因工程技術(shù) 利用分子生物學(xué)技術(shù)設(shè)計(jì)產(chǎn)生雙功能抗體 常見有四種構(gòu)建形式，多為小分子抗體。,20,末端半胱氨

6、酸殘基（Cys）共價(jià)交聯(lián) 在兩種scFv分子C末端分別帶上自由的Cys，通過常規(guī)二硫鍵共價(jià)交聯(lián)，形成雙特異性抗體,,,21,單鏈雙特異性抗體 將兩種scFv分子基因用linker連接在一起，然后表達(dá)形成雙特異性抗體,,22,微型雙特異性抗體 利用專門二聚化結(jié)構(gòu)將兩種scFv分子連接在一起，形成雙特異性抗體 如利用fos和jun基因的亮氨酸拉鏈序列：,,23,雙體型雙特異性抗體 將兩種不同抗體的V

7、H和VL用較短的linker連接形成兩種不同單鏈，當(dāng)它們共表達(dá)時(shí)，其相互間連接在一起，形成雙特異性抗體 1993，Holliger,24,雙特異性抗體的應(yīng)用,免疫診斷腫瘤放射顯影腫瘤藥物殺傷腫瘤的免疫殺傷乳腺癌、淋巴母細(xì)胞白血病、神經(jīng)膠質(zhì)瘤,25,抗體免疫偶聯(lián)物,26,抗體免疫偶聯(lián)物,概述小分子藥物與抗體偶聯(lián)物毒素及大分子多肽藥物與抗體偶聯(lián)物應(yīng)用,27,概述,抗體免疫偶聯(lián)物將單抗與“彈頭”藥物偶聯(lián)在一起，以提高藥

8、物作用的特異性，主要用于腫瘤治療。如，Mylotarg—抗CD33單抗偶聯(lián)加里奇霉素，治療老年人急性髓細(xì)胞性白血病，2000年上市。,28,與單抗偶聯(lián)的常用“彈頭”藥物,29,小分子藥物與抗體偶聯(lián)物,一個(gè)單抗可偶聯(lián)一個(gè)至數(shù)十個(gè)小分子藥物。 抗體分子中的多個(gè)基團(tuán)可以用于連接，如巰基，氨基，羥基，胍基，羧基，糖基等。,30,小分子藥物與抗體偶聯(lián)物,直接偶聯(lián)物 將藥物與單抗直接連接在一起 不同的小分子藥物往往需選擇不同的

9、交聯(lián)劑。2-亞胺四氫噻吩(2-IT)可在具氨基的化合物上引入巰基,31,小分子藥物與抗體偶聯(lián)物,直接偶聯(lián)物 將藥物與單抗直接連接在一起 不同的小分子藥物往往需選擇不同的交聯(lián)劑。SPDP(N-琥珀酰亞胺-3-(2-吡啶二硫基)-丙酸酯)可將巰基引入抗體 如，阿霉素與抗子宮內(nèi)膜腺癌單抗偶聯(lián)，效果提高57倍,32,小分子藥物與抗體偶聯(lián)物,直接偶聯(lián)物 將藥物與單抗直接連接在一起 不同的小分子藥物往往需選擇不同的交聯(lián)

10、劑。PDPH(3-(2-吡啶二硫基)-丙酰肼)可將巰基引入抗體,33,小分子藥物與抗體偶聯(lián)物,直接偶聯(lián)物 將藥物與單抗直接連接在一起 不同的小分子藥物往往需選擇不同的交聯(lián)劑。戊二醛可將藥物與單抗的伯氨基僑聯(lián) 如，柔紅霉素與單抗偶聯(lián),34,小分子藥物與抗體偶聯(lián)物,直接偶聯(lián)物 將藥物與單抗直接連接在一起 不同的小分子藥物往往需選擇不同的交聯(lián)劑?；顫婖タ蓪⒑然幬锱c抗體的氨基相偶聯(lián),35,小分子藥物與抗體偶

11、聯(lián)物,間接偶聯(lián)物 將藥物先與大分子載體相連，然后大分子載體再偶聯(lián)到單抗。Poly-Lys可將含羧基的小分子藥物偶聯(lián)到載體。,36,小分子藥物與抗體偶聯(lián)物,間接偶聯(lián)物 將藥物先與大分子載體相連，然后大分子載體再偶聯(lián)到單抗。Poly-Glu可將含氨基的小分子藥物偶聯(lián)到載體。,37,小分子藥物與抗體偶聯(lián)物,間接偶聯(lián)物 將藥物先與大分子載體相連，然后大分子載體再偶聯(lián)到單抗。Dextran可將含氨基的小分子藥物偶聯(lián)到載體。

12、 如，將平陽(yáng)霉素與抗乳腺癌/肝癌單抗偶聯(lián),38,小分子藥物與抗體偶聯(lián)物,間接偶聯(lián)物 將藥物先與大分子載體相連，然后大分子載體再偶聯(lián)到單抗。脂質(zhì)體脂質(zhì)體與藥物融合，再與抗體連接成免疫脂質(zhì)體 如，阿霉素,39,小分子藥物與抗體偶聯(lián)物,偶聯(lián)要點(diǎn)與存在問題小分子藥物與單抗偶聯(lián)應(yīng)有一定空間距離需提高偶聯(lián)產(chǎn)率偶聯(lián)基團(tuán)應(yīng)避開藥物活性基團(tuán)保留單抗靶向性多個(gè)藥物分子偶聯(lián)簡(jiǎn)單，易重復(fù)不形成抗體、藥物或偶聯(lián)物聚合物,40,毒素

13、及大分子多肽藥物與抗體偶聯(lián)物,毒素和多肽類抗腫瘤藥物分子量較大，具有較強(qiáng)的腫瘤殺傷活性，但選擇性差。同型雙功能偶聯(lián)劑 具有兩個(gè)相同反應(yīng)功能基團(tuán)。雙功能異氰酸酯親脂性偶聯(lián)劑 如，將白喉毒素與抗瘤單抗偶聯(lián),41,毒素及大分子多肽藥物與抗體偶聯(lián)物,毒素和多肽類抗腫瘤藥物分子量較大，具有較強(qiáng)的腫瘤殺傷活性，但選擇性差。同型雙功能偶聯(lián)劑 具有兩個(gè)相同反應(yīng)功能基團(tuán)。脂肪二醛通過其醛基與藥物/單抗的氨基偶聯(lián),42,毒素及

14、大分子多肽藥物與抗體偶聯(lián)物,毒素和多肽類抗腫瘤藥物分子量較大，具有較強(qiáng)的腫瘤殺傷活性，但選擇性差。同型雙功能偶聯(lián)劑 具有兩個(gè)相同反應(yīng)功能基團(tuán)。二馬來(lái)酰亞胺衍生物巰基偶聯(lián)劑,43,毒素及大分子多肽藥物與抗體偶聯(lián)物,毒素和多肽類抗腫瘤藥物分子量較大，具有較強(qiáng)的腫瘤殺傷活性，但選擇性差。同型雙功能偶聯(lián)劑 具有兩個(gè)相同反應(yīng)功能基團(tuán)。特點(diǎn)與不足步驟簡(jiǎn)單，流程短。副反應(yīng)產(chǎn)物多，均一性差，產(chǎn)率低。,44,毒素及大分子多肽藥物

15、與抗體偶聯(lián)物,毒素和多肽類抗腫瘤藥物分子量較大，具有較強(qiáng)的腫瘤殺傷活性，但選擇性差。異型雙功能偶聯(lián)劑 具有兩個(gè)不同反應(yīng)功能基團(tuán)。SPDP先與抗體（藥物）氨基反應(yīng)形成化合物，再與藥物（抗體）巰基反應(yīng)形成偶聯(lián)物。 如，相思豆毒素、蓖麻毒素、力達(dá)霉素與抗瘤單抗偶聯(lián),45,毒素及大分子多肽藥物與抗體偶聯(lián)物,毒素和多肽類抗腫瘤藥物分子量較大，具有較強(qiáng)的腫瘤殺傷活性，但選擇性差。異型雙功能偶聯(lián)劑 具有兩個(gè)不同反應(yīng)功能基團(tuán)。

16、苯丁酸氮芥衍生物先與抗體氨基反應(yīng)形成化合物，再與藥物氨基反應(yīng)形成偶聯(lián)物。,46,毒素及大分子多肽藥物與抗體偶聯(lián)物,毒素和多肽類抗腫瘤藥物分子量較大，具有較強(qiáng)的腫瘤殺傷活性，但選擇性差。異型雙功能偶聯(lián)劑 具有兩個(gè)不同反應(yīng)功能基團(tuán)。馬來(lái)酰亞胺活潑酯先與藥物氨基反應(yīng)形成化合物，再與抗體巰基反應(yīng)形成偶聯(lián)物。,47,毒素及大分子多肽藥物與抗體偶聯(lián)物,毒素和多肽類抗腫瘤藥物分子量較大，具有較強(qiáng)的腫瘤殺傷活性，但選擇性差。異型雙功能

17、偶聯(lián)劑 具有兩個(gè)不同反應(yīng)功能基團(tuán)。特點(diǎn)反應(yīng)溫和，易控制，產(chǎn)物均一性好，產(chǎn)率高。,48,毒素及大分子多肽藥物與抗體偶聯(lián)物,毒素和多肽類抗腫瘤藥物分子量較大，具有較強(qiáng)的腫瘤殺傷活性，但選擇性差。免疫偶聯(lián)物的純化 由于反應(yīng)產(chǎn)物是混合物，故需進(jìn)行分離純化 常用方法有:凝膠過濾、親和層析、離子交換層析、高效液相色譜。,49,毒素及大分子多肽藥物與抗體偶聯(lián)物,研究趨勢(shì)連接可控性，高產(chǎn)率，高產(chǎn)物均一性。選擇性連接抗體和藥物

18、某一特定基團(tuán)偶聯(lián)物在體內(nèi)穩(wěn)定循環(huán)，并能在腫瘤部位激活或釋放,50,抗體偶聯(lián)藥物的研究與應(yīng)用,51,單抗-藥物的臨床腫瘤治療試驗(yàn),52,抗體偶聯(lián)藥物的研究與應(yīng)用,單抗-毒素的臨床試驗(yàn)研究廣泛，具一定效果，但與期望尚有距離。,53,單抗-毒素的臨床腫瘤治療試驗(yàn),54,抗體融合蛋白,55,抗體融合蛋白,概述重組免疫毒素基因工程抗體-酶基因工程抗體-細(xì)胞因子抗體-超抗原免疫粘連素,56,概述,抗體融合蛋白將抗體（片段）與其它效應(yīng)

19、蛋白基因融合，構(gòu)建融合表達(dá)載體，然后在合適的表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)融合蛋白。融合蛋白具均一性，易生產(chǎn),57,重組免疫毒素,將單抗分子與毒素蛋白融合表達(dá)重組免疫毒素的構(gòu)建常用毒素白喉毒素及其衍生物 白喉?xiàng)U菌所產(chǎn)生，修飾延長(zhǎng)因子,阻斷蛋白合成 毒性極強(qiáng),1-2個(gè)分子即可殺死1個(gè)細(xì)胞。 腫瘤細(xì)胞敏感 體內(nèi)水解為A/B兩片段，A為毒性部分，B為結(jié)合部分,58,重組免疫毒素,將單抗分子與毒素蛋白融合表達(dá)重組免疫毒素的構(gòu)建

20、常用毒素假單胞桿菌外毒素及其衍生物 不可逆修飾延長(zhǎng)因子,阻斷蛋白合成 毒性很強(qiáng) 單鏈，分結(jié)合部與毒性部位,59,重組免疫毒素,將單抗分子與毒素蛋白融合表達(dá)重組免疫毒素的構(gòu)建常用毒素蓖麻毒素及其衍生物 滅活核糖體，抑制蛋白合成 體內(nèi)水解為A/B兩鏈,A為毒性部分,B為結(jié)合部分,60,重組免疫毒素,將單抗分子與毒素蛋白融合表達(dá)重組免疫毒素的構(gòu)建構(gòu)建重組免疫毒素 常用抗體片段的C端與毒素融合,61

21、,重組免疫毒素,將單抗分子與毒素蛋白融合表達(dá)臨床試驗(yàn)與研究血液惡性腫瘤靶向IL-2受體的免疫毒素 多數(shù)T/B細(xì)胞型白血病與淋巴瘤都過度表達(dá)IL-2受體亞基CD25 如，抗CD25單抗-假單胞桿菌外毒素衍生物 （臨床）,62,重組免疫毒素,將單抗分子與毒素蛋白融合表達(dá)臨床試驗(yàn)與研究血液惡性腫瘤靶向CD22的免疫毒素 約70%B細(xì)胞型淋巴瘤和白血病為CD22陽(yáng)性 如，抗CD22單抗-假單胞桿菌外毒素衍生物

22、 （臨床前）,63,重組免疫毒素,將單抗分子與毒素蛋白融合表達(dá)臨床試驗(yàn)與研究血液惡性腫瘤其他靶向血液抗原的免疫毒素 CD19,CD6,CD30,CD33,CD46,64,重組免疫毒素,將單抗分子與毒素蛋白融合表達(dá)臨床試驗(yàn)與研究實(shí)體瘤抗Lewis Y重組疫毒素 Lewis Y存在于結(jié)腸癌，乳腺癌，胃癌，肺癌，膀胱癌表面。 如，抗Lewis Y單抗-假單胞桿菌外毒素衍生物，對(duì)結(jié)腸癌和乳腺癌有確切療效。,6

23、5,重組免疫毒素,將單抗分子與毒素蛋白融合表達(dá)臨床試驗(yàn)與研究實(shí)體瘤抗Her2/neu重組疫毒素 Her2/neu 在乳腺癌，肝癌，卵巢癌，胃癌，有高表達(dá)。 抗Her2單抗-假單胞桿菌外毒素衍生物(臨床),66,重組免疫毒素,將單抗分子與毒素蛋白融合表達(dá)存在問題特異性非特異性毒性血管滲漏—內(nèi)皮細(xì)胞損傷免疫原性實(shí)體瘤滲透,67,基因工程抗體-酶,把單抗分子與酶融合表達(dá)，使特定的催化效應(yīng)靶向特定的

24、部位?？贵w介導(dǎo)的酶-前藥療法 酶集中于靶標(biāo)部位，催化無(wú)或低活性的抗癌前藥轉(zhuǎn)化為胞毒性藥物，從而發(fā)揮藥物特異性釋放、活化，提高療效。抗CEA抗體-β-葡萄苷酸酶前藥—doxorubicin葡萄苷酸衍生物療效顯著提高,68,基因工程抗體-酶,把單抗分子與酶融合表達(dá)，使特定的催化效應(yīng)靶向特定的部位?？贵w介導(dǎo)的酶-前藥療法抗p97抗體-β-內(nèi)酰胺酶P97—黑瘤抗原前藥—7-(4-羧基丁酰胺)-頭孢菌素氮芥療效較化學(xué)

25、偶聯(lián)物顯著提高,69,基因工程抗體-酶,把單抗分子與酶融合表達(dá)，使特定的催化效應(yīng)靶向特定的部位?；诤怂崦傅娜诤系鞍?核酸酶與單抗融合，靶向腫瘤細(xì)胞核糖核酸酶免疫毒素多種核糖核酸酶具抗瘤活性如，牛胰/牛精核糖核酸酶,70,基因工程抗體-酶,把單抗分子與酶融合表達(dá)，使特定的催化效應(yīng)靶向特定的部位。靶向溶栓劑 血纖溶酶原激活劑與單抗融合，靶向凝血塊 如，尿激酶血纖溶酶原激活劑/組織血纖溶酶原激活劑與血塊單抗融合,

26、71,基因工程抗體-細(xì)胞因子,把單抗分子與細(xì)胞因子融合表達(dá)，發(fā)揮抗腫瘤作用?？贵w-IL-2 抗黑瘤抗體-IL-2 臨床前試驗(yàn)效果顯著，已進(jìn)入臨床試驗(yàn),72,基因工程抗體-細(xì)胞因子,把單抗分子與細(xì)胞因子融合表達(dá)，發(fā)揮抗腫瘤作用?？贵w-GM-SCF 強(qiáng)化腫瘤特異性免疫,73,基因工程抗體-細(xì)胞因子,把單抗分子與細(xì)胞因子融合表達(dá)，發(fā)揮抗腫瘤作用?？贵w-IL-12 增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞活性。,74,基因工程

27、抗體-細(xì)胞因子,把單抗分子與細(xì)胞因子融合表達(dá)，發(fā)揮抗腫瘤作用?？贵w-B7 增強(qiáng)腫瘤特異性免疫,75,基因工程抗體-超抗原,常用超抗原SEA 葡萄球菌腸毒素，可激活大量T細(xì)胞，產(chǎn)生極強(qiáng)免疫應(yīng)答。,76,基因工程抗體-超抗原,抗體-SEAFab-SEA 黑色素瘤動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，明顯延長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生存時(shí)間?？笴D19-SEA B細(xì)胞白血病動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，療效顯著。,77,基因工程抗體-超抗原,抗體-SEA抗結(jié)