雙特異性抗體與抗體融合蛋白

1、雙特異性抗體,2,雙特異性抗體,概述構(gòu)建策略應(yīng)用,3,概述,雙特異性抗體：抗體兩個結(jié)合點表現(xiàn)為不同的特異性，即分別結(jié)合不同表位。如，一個結(jié)合靶細(xì)胞（如腫瘤細(xì)胞），另一結(jié)合藥物或免疫效應(yīng)細(xì)胞（如蓖麻毒素、抗癌藥物、細(xì)胞毒性細(xì)胞）,4,雙特異性抗體,5,,6,雙特異性抗體的功用：提高療效，減少副作用。主要用于靶向治療。,7,構(gòu)建策略,雙特異性抗體的靶標(biāo) 一個結(jié)合治療靶標(biāo)，另一個指向體內(nèi)效應(yīng)細(xì)胞T細(xì)胞 TCR

2、CD3 CD2,8,構(gòu)建策略,雙特異性抗體的靶標(biāo) 一個結(jié)合治療靶標(biāo)，另一個指向體內(nèi)效應(yīng)細(xì)胞吞噬細(xì)胞/APC FcγR、CR,9,構(gòu)建策略,雙特異性抗體的靶標(biāo) 一個結(jié)合治療靶標(biāo)，另一個指向體內(nèi)效應(yīng)細(xì)胞NK細(xì)胞 FcγR、CD56,10,雙特異性抗體的效應(yīng)靶,11,構(gòu)建策略,雙特異性抗體的構(gòu)建方法雜化雜交瘤技術(shù) 將具有某種特異性（如抗瘤細(xì)胞）的McAb細(xì)胞株與具有抗第二抗原（如蓖麻毒蛋白）

3、的小鼠脾細(xì)胞進行融合，即產(chǎn)生出雜化雜交瘤細(xì)胞株的二價瘤體。,12,雜化雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生的雙特異性抗體,13,雜化雜交瘤分泌的抗體形式 保持原特異性抗體分子： L1H1-H1L1，L2H2-H2L2 重鏈特異性相同的配對抗體分子： L1H1-H1L2，L1H2-H2L1 L2H1-H1L2，L1H2-H2L2 重鏈、輕鏈特異性不同的配對抗體分子： L1H1-H2L2，L1H2-H1L

4、2 L1H1-H2L1，L2H2-H1L2,14,只有L1H1-H2L2才是所需的雙特異性抗體,15,雜化雜交瘤方法的不足 產(chǎn)量低，僅占10% 產(chǎn)物需篩選，費時費力 瘤株不穩(wěn)定,16,構(gòu)建策略,雙特異性抗體的構(gòu)建方法化學(xué)交聯(lián)法 Nisonoff和Rivers最早開始研究 化學(xué)交聯(lián)無需經(jīng)過細(xì)胞融合，比較簡便易行。 通常利用重鏈與輕鏈這間的二硫鏈經(jīng)還原和再氧化，將兩種不同特異性抗體的半分子結(jié)合

5、在一起?；蛴秒p功能交聯(lián)劑，如鄰苯酸酯等，把兩個抗體半分子交聯(lián)在一起。,17,化學(xué)交聯(lián)的雙特異性抗體,18,構(gòu)建策略,雙特異性抗體的構(gòu)建方法化學(xué)交聯(lián)法 用于制備雙功能抗體的McAb可以是完整分子，也可是經(jīng)胃酶水解獲得F（abˊ）2片段。后者在減少鼠源免疫原性方面，效果較好。,19,構(gòu)建策略,雙特異性抗體的構(gòu)建方法基因工程技術(shù) 利用分子生物學(xué)技術(shù)設(shè)計產(chǎn)生雙功能抗體 常見有四種構(gòu)建形式，多為小分子抗體。,20,末端半胱氨

6、酸殘基（Cys）共價交聯(lián) 在兩種scFv分子C末端分別帶上自由的Cys，通過常規(guī)二硫鍵共價交聯(lián)，形成雙特異性抗體,,,21,單鏈雙特異性抗體 將兩種scFv分子基因用linker連接在一起，然后表達形成雙特異性抗體,,22,微型雙特異性抗體 利用專門二聚化結(jié)構(gòu)將兩種scFv分子連接在一起，形成雙特異性抗體 如利用fos和jun基因的亮氨酸拉鏈序列：,,23,雙體型雙特異性抗體 將兩種不同抗體的V

7、H和VL用較短的linker連接形成兩種不同單鏈，當(dāng)它們共表達時，其相互間連接在一起，形成雙特異性抗體 1993，Holliger,24,雙特異性抗體的應(yīng)用,免疫診斷腫瘤放射顯影腫瘤藥物殺傷腫瘤的免疫殺傷乳腺癌、淋巴母細(xì)胞白血病、神經(jīng)膠質(zhì)瘤,25,抗體免疫偶聯(lián)物,26,抗體免疫偶聯(lián)物,概述小分子藥物與抗體偶聯(lián)物毒素及大分子多肽藥物與抗體偶聯(lián)物應(yīng)用,27,概述,抗體免疫偶聯(lián)物將單抗與“彈頭”藥物偶聯(lián)在一起，以提高藥

8、物作用的特異性，主要用于腫瘤治療。如，Mylotarg—抗CD33單抗偶聯(lián)加里奇霉素，治療老年人急性髓細(xì)胞性白血病，2000年上市。,28,與單抗偶聯(lián)的常用“彈頭”藥物,29,小分子藥物與抗體偶聯(lián)物,一個單抗可偶聯(lián)一個至數(shù)十個小分子藥物。 抗體分子中的多個基團可以用于連接，如巰基，氨基，羥基，胍基，羧基，糖基等。,30,小分子藥物與抗體偶聯(lián)物,直接偶聯(lián)物 將藥物與單抗直接連接在一起 不同的小分子藥物往往需選擇不同的

9、交聯(lián)劑。2-亞胺四氫噻吩(2-IT)可在具氨基的化合物上引入巰基,31,小分子藥物與抗體偶聯(lián)物,直接偶聯(lián)物 將藥物與單抗直接連接在一起 不同的小分子藥物往往需選擇不同的交聯(lián)劑。SPDP(N-琥珀酰亞胺-3-(2-吡啶二硫基)-丙酸酯)可將巰基引入抗體 如，阿霉素與抗子宮內(nèi)膜腺癌單抗偶聯(lián)，效果提高57倍,32,小分子藥物與抗體偶聯(lián)物,直接偶聯(lián)物 將藥物與單抗直接連接在一起 不同的小分子藥物往往需選擇不同的交聯(lián)

10、劑。PDPH(3-(2-吡啶二硫基)-丙酰肼)可將巰基引入抗體,33,小分子藥物與抗體偶聯(lián)物,直接偶聯(lián)物 將藥物與單抗直接連接在一起 不同的小分子藥物往往需選擇不同的交聯(lián)劑。戊二醛可將藥物與單抗的伯氨基僑聯(lián) 如，柔紅霉素與單抗偶聯(lián),34,小分子藥物與抗體偶聯(lián)物,直接偶聯(lián)物 將藥物與單抗直接連接在一起 不同的小分子藥物往往需選擇不同的交聯(lián)劑?；顫婖タ蓪⒑然幬锱c抗體的氨基相偶聯(lián),35,小分子藥物與抗體偶

11、聯(lián)物,間接偶聯(lián)物 將藥物先與大分子載體相連，然后大分子載體再偶聯(lián)到單抗。Poly-Lys可將含羧基的小分子藥物偶聯(lián)到載體。,36,小分子藥物與抗體偶聯(lián)物,間接偶聯(lián)物 將藥物先與大分子載體相連，然后大分子載體再偶聯(lián)到單抗。Poly-Glu可將含氨基的小分子藥物偶聯(lián)到載體。,37,小分子藥物與抗體偶聯(lián)物,間接偶聯(lián)物 將藥物先與大分子載體相連，然后大分子載體再偶聯(lián)到單抗。Dextran可將含氨基的小分子藥物偶聯(lián)到載體。

12、 如，將平陽霉素與抗乳腺癌/肝癌單抗偶聯(lián),38,小分子藥物與抗體偶聯(lián)物,間接偶聯(lián)物 將藥物先與大分子載體相連，然后大分子載體再偶聯(lián)到單抗。脂質(zhì)體脂質(zhì)體與藥物融合，再與抗體連接成免疫脂質(zhì)體 如，阿霉素,39,小分子藥物與抗體偶聯(lián)物,偶聯(lián)要點與存在問題小分子藥物與單抗偶聯(lián)應(yīng)有一定空間距離需提高偶聯(lián)產(chǎn)率偶聯(lián)基團應(yīng)避開藥物活性基團保留單抗靶向性多個藥物分子偶聯(lián)簡單，易重復(fù)不形成抗體、藥物或偶聯(lián)物聚合物,40,毒素

13、及大分子多肽藥物與抗體偶聯(lián)物,毒素和多肽類抗腫瘤藥物分子量較大，具有較強的腫瘤殺傷活性，但選擇性差。同型雙功能偶聯(lián)劑 具有兩個相同反應(yīng)功能基團。雙功能異氰酸酯親脂性偶聯(lián)劑 如，將白喉毒素與抗瘤單抗偶聯(lián),41,毒素及大分子多肽藥物與抗體偶聯(lián)物,毒素和多肽類抗腫瘤藥物分子量較大，具有較強的腫瘤殺傷活性，但選擇性差。同型雙功能偶聯(lián)劑 具有兩個相同反應(yīng)功能基團。脂肪二醛通過其醛基與藥物/單抗的氨基偶聯(lián),42,毒素及

14、大分子多肽藥物與抗體偶聯(lián)物,毒素和多肽類抗腫瘤藥物分子量較大，具有較強的腫瘤殺傷活性，但選擇性差。同型雙功能偶聯(lián)劑 具有兩個相同反應(yīng)功能基團。二馬來酰亞胺衍生物巰基偶聯(lián)劑,43,毒素及大分子多肽藥物與抗體偶聯(lián)物,毒素和多肽類抗腫瘤藥物分子量較大，具有較強的腫瘤殺傷活性，但選擇性差。同型雙功能偶聯(lián)劑 具有兩個相同反應(yīng)功能基團。特點與不足步驟簡單，流程短。副反應(yīng)產(chǎn)物多，均一性差，產(chǎn)率低。,44,毒素及大分子多肽藥物

15、與抗體偶聯(lián)物,毒素和多肽類抗腫瘤藥物分子量較大，具有較強的腫瘤殺傷活性，但選擇性差。異型雙功能偶聯(lián)劑 具有兩個不同反應(yīng)功能基團。SPDP先與抗體（藥物）氨基反應(yīng)形成化合物，再與藥物（抗體）巰基反應(yīng)形成偶聯(lián)物。 如，相思豆毒素、蓖麻毒素、力達霉素與抗瘤單抗偶聯(lián),45,毒素及大分子多肽藥物與抗體偶聯(lián)物,毒素和多肽類抗腫瘤藥物分子量較大，具有較強的腫瘤殺傷活性，但選擇性差。異型雙功能偶聯(lián)劑 具有兩個不同反應(yīng)功能基團。

16、苯丁酸氮芥衍生物先與抗體氨基反應(yīng)形成化合物，再與藥物氨基反應(yīng)形成偶聯(lián)物。,46,毒素及大分子多肽藥物與抗體偶聯(lián)物,毒素和多肽類抗腫瘤藥物分子量較大，具有較強的腫瘤殺傷活性，但選擇性差。異型雙功能偶聯(lián)劑 具有兩個不同反應(yīng)功能基團。馬來酰亞胺活潑酯先與藥物氨基反應(yīng)形成化合物，再與抗體巰基反應(yīng)形成偶聯(lián)物。,47,毒素及大分子多肽藥物與抗體偶聯(lián)物,毒素和多肽類抗腫瘤藥物分子量較大，具有較強的腫瘤殺傷活性，但選擇性差。異型雙功能

17、偶聯(lián)劑 具有兩個不同反應(yīng)功能基團。特點反應(yīng)溫和，易控制，產(chǎn)物均一性好，產(chǎn)率高。,48,毒素及大分子多肽藥物與抗體偶聯(lián)物,毒素和多肽類抗腫瘤藥物分子量較大，具有較強的腫瘤殺傷活性，但選擇性差。免疫偶聯(lián)物的純化 由于反應(yīng)產(chǎn)物是混合物，故需進行分離純化 常用方法有:凝膠過濾、親和層析、離子交換層析、高效液相色譜。,49,毒素及大分子多肽藥物與抗體偶聯(lián)物,研究趨勢連接可控性，高產(chǎn)率，高產(chǎn)物均一性。選擇性連接抗體和藥物

18、某一特定基團偶聯(lián)物在體內(nèi)穩(wěn)定循環(huán)，并能在腫瘤部位激活或釋放,50,抗體偶聯(lián)藥物的研究與應(yīng)用,51,單抗-藥物的臨床腫瘤治療試驗,52,抗體偶聯(lián)藥物的研究與應(yīng)用,單抗-毒素的臨床試驗研究廣泛，具一定效果，但與期望尚有距離。,53,單抗-毒素的臨床腫瘤治療試驗,54,抗體融合蛋白,55,抗體融合蛋白,概述重組免疫毒素基因工程抗體-酶基因工程抗體-細(xì)胞因子抗體-超抗原免疫粘連素,56,概述,抗體融合蛋白將抗體（片段）與其它效應(yīng)

19、蛋白基因融合，構(gòu)建融合表達載體，然后在合適的表達系統(tǒng)生產(chǎn)融合蛋白。融合蛋白具均一性，易生產(chǎn),57,重組免疫毒素,將單抗分子與毒素蛋白融合表達重組免疫毒素的構(gòu)建常用毒素白喉毒素及其衍生物 白喉桿菌所產(chǎn)生，修飾延長因子,阻斷蛋白合成 毒性極強,1-2個分子即可殺死1個細(xì)胞。 腫瘤細(xì)胞敏感 體內(nèi)水解為A/B兩片段，A為毒性部分，B為結(jié)合部分,58,重組免疫毒素,將單抗分子與毒素蛋白融合表達重組免疫毒素的構(gòu)建

20、常用毒素假單胞桿菌外毒素及其衍生物 不可逆修飾延長因子,阻斷蛋白合成 毒性很強 單鏈，分結(jié)合部與毒性部位,59,重組免疫毒素,將單抗分子與毒素蛋白融合表達重組免疫毒素的構(gòu)建常用毒素蓖麻毒素及其衍生物 滅活核糖體，抑制蛋白合成 體內(nèi)水解為A/B兩鏈,A為毒性部分,B為結(jié)合部分,60,重組免疫毒素,將單抗分子與毒素蛋白融合表達重組免疫毒素的構(gòu)建構(gòu)建重組免疫毒素 常用抗體片段的C端與毒素融合,61

21、,重組免疫毒素,將單抗分子與毒素蛋白融合表達臨床試驗與研究血液惡性腫瘤靶向IL-2受體的免疫毒素 多數(shù)T/B細(xì)胞型白血病與淋巴瘤都過度表達IL-2受體亞基CD25 如，抗CD25單抗-假單胞桿菌外毒素衍生物 （臨床）,62,重組免疫毒素,將單抗分子與毒素蛋白融合表達臨床試驗與研究血液惡性腫瘤靶向CD22的免疫毒素 約70%B細(xì)胞型淋巴瘤和白血病為CD22陽性 如，抗CD22單抗-假單胞桿菌外毒素衍生物

22、 （臨床前）,63,重組免疫毒素,將單抗分子與毒素蛋白融合表達臨床試驗與研究血液惡性腫瘤其他靶向血液抗原的免疫毒素 CD19,CD6,CD30,CD33,CD46,64,重組免疫毒素,將單抗分子與毒素蛋白融合表達臨床試驗與研究實體瘤抗Lewis Y重組疫毒素 Lewis Y存在于結(jié)腸癌，乳腺癌，胃癌，肺癌，膀胱癌表面。 如，抗Lewis Y單抗-假單胞桿菌外毒素衍生物，對結(jié)腸癌和乳腺癌有確切療效。,6

23、5,重組免疫毒素,將單抗分子與毒素蛋白融合表達臨床試驗與研究實體瘤抗Her2/neu重組疫毒素 Her2/neu 在乳腺癌，肝癌，卵巢癌，胃癌，有高表達。 抗Her2單抗-假單胞桿菌外毒素衍生物(臨床),66,重組免疫毒素,將單抗分子與毒素蛋白融合表達存在問題特異性非特異性毒性血管滲漏—內(nèi)皮細(xì)胞損傷免疫原性實體瘤滲透,67,基因工程抗體-酶,把單抗分子與酶融合表達，使特定的催化效應(yīng)靶向特定的

24、部位?？贵w介導(dǎo)的酶-前藥療法 酶集中于靶標(biāo)部位，催化無或低活性的抗癌前藥轉(zhuǎn)化為胞毒性藥物，從而發(fā)揮藥物特異性釋放、活化，提高療效?？笴EA抗體-β-葡萄苷酸酶前藥—doxorubicin葡萄苷酸衍生物療效顯著提高,68,基因工程抗體-酶,把單抗分子與酶融合表達，使特定的催化效應(yīng)靶向特定的部位。抗體介導(dǎo)的酶-前藥療法抗p97抗體-β-內(nèi)酰胺酶P97—黑瘤抗原前藥—7-(4-羧基丁酰胺)-頭孢菌素氮芥療效較化學(xué)

25、偶聯(lián)物顯著提高,69,基因工程抗體-酶,把單抗分子與酶融合表達，使特定的催化效應(yīng)靶向特定的部位。基于核酸酶的融合蛋白 核酸酶與單抗融合，靶向腫瘤細(xì)胞核糖核酸酶免疫毒素多種核糖核酸酶具抗瘤活性如，牛胰/牛精核糖核酸酶,70,基因工程抗體-酶,把單抗分子與酶融合表達，使特定的催化效應(yīng)靶向特定的部位。靶向溶栓劑 血纖溶酶原激活劑與單抗融合，靶向凝血塊 如，尿激酶血纖溶酶原激活劑/組織血纖溶酶原激活劑與血塊單抗融合,

26、71,基因工程抗體-細(xì)胞因子,把單抗分子與細(xì)胞因子融合表達，發(fā)揮抗腫瘤作用?？贵w-IL-2 抗黑瘤抗體-IL-2 臨床前試驗效果顯著，已進入臨床試驗,72,基因工程抗體-細(xì)胞因子,把單抗分子與細(xì)胞因子融合表達，發(fā)揮抗腫瘤作用?？贵w-GM-SCF 強化腫瘤特異性免疫,73,基因工程抗體-細(xì)胞因子,把單抗分子與細(xì)胞因子融合表達，發(fā)揮抗腫瘤作用?？贵w-IL-12 增強CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞活性。,74,基因工程

27、抗體-細(xì)胞因子,把單抗分子與細(xì)胞因子融合表達，發(fā)揮抗腫瘤作用?？贵w-B7 增強腫瘤特異性免疫,75,基因工程抗體-超抗原,常用超抗原SEA 葡萄球菌腸毒素，可激活大量T細(xì)胞，產(chǎn)生極強免疫應(yīng)答。,76,基因工程抗體-超抗原,抗體-SEAFab-SEA 黑色素瘤動物實驗，明顯延長實驗動物生存時間?？笴D19-SEA B細(xì)胞白血病動物實驗，療效顯著。,77,基因工程抗體-超抗原,抗體-SEA抗結(jié)