卡氏肺孢子蟲特異性DNA探針的制備及其實(shí)驗(yàn)應(yīng)用.pdf

1、該研究采用醋酸潑尼松龍誘導(dǎo)建立卡氏肺孢子蟲肺炎(Pneumocystis carinii pneumonia,PCP)大鼠模型,獲得實(shí)驗(yàn)所需的基本材料.以隨機(jī)引物法制備地高辛標(biāo)記的非放射性探針,采用斑點(diǎn)雜交檢測(cè)大鼠模型肺組織和患者臨床標(biāo)本中的卡氏肺孢子蟲(Pneumocystis carinii,Pc)DNA.1.PCP大鼠模型的建立、Pc檢測(cè)及實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的采集;采用SD大鼠,醋酸潑尼松龍腹股溝皮下注射2個(gè)月,誘導(dǎo)建立PCP動(dòng)物模型.結(jié)果

2、:病原學(xué)檢查結(jié)果顯示成功建立了PCP動(dòng)物模型.檢測(cè)結(jié)果顯示,吉氏染色檢出率為80﹪,快速銀染檢出率為50﹪,PCR檢出率為95﹪,后者明顯高于吉氏染色和快速銀染法.PCP動(dòng)物模型的誘導(dǎo)成功及肺組織的獲得為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究奠定了基礎(chǔ).2.Pc特異性目的基因的獲得及序列測(cè)定;以Wakefield等設(shè)計(jì)的PAZ102-E和PAZ102-H為引物,采用常規(guī)PCR擴(kuò)增Pc的線粒體核糖體RNA大亞基(LSU mt rRNA)基因.結(jié)果:測(cè)序結(jié)果顯示所

3、得基因片段長(zhǎng)為357bp,與GeneBank中的已有序列比對(duì),結(jié)果顯示所得基因與Sinclair等公布的Pc LSU mt rRNA基因的同源性為99﹪,故確認(rèn)是Pc特異的基因.以獲得的Pc特異性DNA為模板,采用隨機(jī)引物法制備地高辛標(biāo)記的非放射性探針.以已知濃度的地高辛標(biāo)記的DNA為參照確定探針的濃度,隨后檢測(cè)該探針的特異性和敏感性.結(jié)果:實(shí)驗(yàn)中所得探針濃度為30ng/ul,顯色敏感性為1pg,雜交敏感性為2pg,特異性檢測(cè)顯示該探針