左旋氧氟沙星抗體Fab片段的制備及其特性研究.pdf

1、左旋氧氟沙星（S-Ofloxacin，S-OFL）是第三代氟喹諾酮類抗菌藥氧氟沙星的左旋異構體，因其廣譜殺菌性、抗菌活性強、價格便宜等而廣泛應用。為規(guī)范其使用和檢測其在食品中殘留情況，基于抗原-抗體結合的酶聯(lián)免疫法近年來被應用于食品中左旋氧氟沙星的快速檢測中。然而在實際檢測中，氧氟沙星不同旋光異構體與抗體結合時表現(xiàn)出不同的選擇結合特性。為進一步探究氧氟沙星與手性抗體結合的手性識別機制，本文主要進行了如下幾個方面的工作：
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2、S-OFL單克隆抗體的制備、純化和鑒定
　　復蘇實驗室前期制備的細胞株，通過小鼠制備腹水，測定其效價為16000、抑制64％以上、亞型為IgG1。用蛋白G親和層析法進行純化，SDS-PAGE電泳和ELISA結果表明制備的S-OFL單克隆抗體具有很高的純度和很好的活性。
　?。?）無花果蛋白酶酶解純化制備Fab片段
　　使用無花果蛋白酶酶解抗體，通過優(yōu)化得酶解條件為：酶和抗體的質量比為0.012 mg酶/mg IgG、2

3、5 mM Cys濃度的酶活化/消化液（pH為5.6）、酶解時間為7小時。采用蛋白G親和層析法純化和凝膠過濾層析法分離酶解產(chǎn)物，得到的Fab片段發(fā)生了聚集且失去了活性。研究分析發(fā)現(xiàn)這主要是由于環(huán)境 pH的影響，F(xiàn)ab片段及酶解碎片發(fā)生二硫化物互換反應而形成聚集、改變空間構型導致的。
　　（3）木瓜蛋白酶酶解純化制備Fab片段
　　使用木瓜蛋白酶酶解抗體，通過優(yōu)化得酶解條件為：酶和抗體的質量比為0.0083 mg酶/mg IgG

4、、20 mM Cys濃度的酶活化/消化液（pH為7）、酶解時間為8小時。采用親和層析法純化和凝膠過濾層析柱分離酶解產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)抗體鉸鏈區(qū)存在兩個酶切位點，在酶切的過程中酶首先作用與鉸鏈區(qū)近C-端而產(chǎn)生58 kD的Fab’片段，接著繼續(xù)作用在鉸鏈區(qū)近N-端而產(chǎn)生42 kD的Fab片段。對Fab片段N-端進行測序發(fā)現(xiàn)Fd段及輕鏈雖然分別被酶切掉3個和2個氨基酸，但其關鍵的CDR區(qū)得到了較好的保存，因此Fab片段仍然保持較好的活性。