抗眼鏡蛇毒雞卵黃抗體的制備及其特性研究.pdf

1、背景：毒蛇咬傷是一世界性的普遍問題，據(jù)WHO有關(guān)材料表明，目前世界上每年估計(jì)約有50萬人遭受毒蛇咬傷。我國已知有毒蛇48種，毒蛇咬傷主要發(fā)生在南方地區(qū)，我省素有養(yǎng)蛇、食蛇的生活習(xí)慣，毒蛇咬傷甚為突出，據(jù)國家衛(wèi)生部資料顯示，南方幾省近5年毒蛇咬傷危重病人：傷18萬人、死亡2.5萬人，蛇咬傷病人每年以3％的速度逐年上升，不亞于交通事故傷，已構(gòu)成城鄉(xiāng)醫(yī)院常見急診之一<'[1]>。傳統(tǒng)的蛇傷治療是精制的抗蛇毒血清，由于該制劑中的馬源lgG系異種

2、蛋白，故常發(fā)生過敏反應(yīng)，一般多見的有皮疹、喉頭水腫、血壓下降，四肢關(guān)節(jié)疼痛、血清病、過敏性休克等Ⅲ型變態(tài)反應(yīng)<'[2]>。近年來用原始、脫毒或丫射線照射(γ-irradiated)的蛇毒作抗原，免疫母雞后12～15天，即可從雞卵黃中分離出相應(yīng)的免疫球蛋白(Immunoglobulinyolk，簡稱IgY)。與現(xiàn)有的馬血清lgG相比，IgY具有產(chǎn)率高、成本低、穩(wěn)定性好、特異性強(qiáng)、過敏性小及顯著減少由于抗體采集而造成對動物的傷害<'[3]>

3、等優(yōu)點(diǎn)，因此，IgY已成為新一代蛇傷特效藥物研制的一個(gè)重要方向。 目的： 制備抗眼鏡蛇毒雞卵黃抗體(簡稱：抗眼鏡蛇毒IgY)，探索制備高效價(jià)抗體的免疫方案；優(yōu)化純化方法，開發(fā)鑒定抗體特性的新方法；為替代馬源性抗蛇毒血清奠定基礎(chǔ)。 方法： 一、抗眼鏡蛇毒IgY的制備、純化 1、抗眼鏡蛇毒lgY的制備優(yōu)化免疫方案，利用本所專利-蛇毒取毒器制備抗原眼鏡蛇毒，以小劑量眼鏡蛇毒粗毒與福氏佐劑混合制成油包水的

4、乳狀顆粒，免疫產(chǎn)蛋率高的萊杭母雞，以間歇、逐漸加量的加強(qiáng)免疫方案制備抗眼鏡蛇毒IgY抗體。 2、以間接ELISA法檢測特異性IgY抗體效價(jià)的動態(tài)變化；雙向免疫擴(kuò)散和免疫電泳鑒定卵黃中的特異性抗體；SDS-PAGE測定各級純化抗體產(chǎn)物的純度。 3、抗眼鏡蛇毒IgY的純化采用本實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)明的卵黃分離收集器從卵清中分離出卵黃，用水稀釋法粗提IgY抗體，采用硫酸銨沉淀，陰離子交換層析，嗜硫色譜，疏水色譜，凝膠層析及辛酸-硫酸銨

5、沉淀等多種純化方案提取、純化抗體，并與商業(yè)上的EGG STRACT純化試劑盒進(jìn)行純度、回收率及效價(jià)方面的比較，探索純化方法，優(yōu)化純化方案。 二、抗眼鏡蛇毒IgY的免疫特性研究 1、利用雙向免疫擴(kuò)散法測定抗眼鏡蛇毒IgY與中國常見9種蛇毒的交叉免疫反應(yīng)及其反應(yīng)強(qiáng)度，并與精制馬源性抗眼鏡蛇毒血清作了效價(jià)比較。用免疫印跡法比較IgY與馬源性抗體的免疫特性。 2、優(yōu)化SDS-PAGE法的實(shí)驗(yàn)條件，用于測定IgY抗體與眼鏡

6、蛇毒的最佳反應(yīng)濃度比例，測定IgY抗體的熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性及抗體交叉反應(yīng)特性。利用The ImageQuant TL 1D分析SDS-PAGE蛋白條帶。 三、抗眼鏡蛇毒lgY的生物活性研究 1、抗眼鏡蛇毒IgY對小白鼠的保護(hù)作用小鼠體外中和實(shí)驗(yàn)檢測所制IgY的生物活性； 2、雞血清抗體對自身的保護(hù)作用第一次免疫40周后，4倍LD<,50>眼鏡蛇毒攻擊已免疫母雞，ELISA檢測攻擊前后雞血中抗體效價(jià)變化并觀察蛇毒

7、注射局部病理變化情況，未經(jīng)眼鏡蛇毒免疫的母雞作陰性對照。 3、建立眼鏡蛇傷/IgY抗體保護(hù)模型利用BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)測定模型(大鼠)的呼吸、心率、心電以及血壓等生理指標(biāo)變化；利用Olympus 2700大型生化分析儀檢測大鼠的心、肝、腎主要功能酶及有關(guān)生化指標(biāo)的變化。 四、統(tǒng)計(jì)采用t、X<'2>檢驗(yàn)，SPSS軟件等統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。 結(jié)果： 1、利用蛇毒取毒器制備的蛇毒活性高，含雜質(zhì)量少。用眼

8、鏡蛇毒粗毒、初次小劑量免疫后，經(jīng)ELISA法卵黃中第7天(雙向免疫擴(kuò)散法第13天)即可檢測到特異性卵黃抗體。經(jīng)間歇、逐漸加量加強(qiáng)免疫，抗體效價(jià)持續(xù)增高，達(dá)到較高水平(128000)后呈生物節(jié)律性波動并維持高效價(jià)直到第40W。 2、實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)明卵黃分離收集器(專利號：2006200559807.3)，利用此儀器收集試驗(yàn)用卵黃，卵清、卵黃分離度高，卵黃膜光潔、完整，卵清殘留量少，有利于下一步的分離純化。 3、水稀釋法去脂效

9、果好，進(jìn)一步經(jīng)硫酸銨鹽析后，蛋白回收率為40．36％，再經(jīng)陰離子交換層析，總蛋白回收率14.86％，效價(jià)提高24倍。辛酸-硫酸銨沉淀法純化卵黃抗體，回收率為88.2mg/egg，純度可達(dá)電泳純，效價(jià)比EGG Stract試劑盒純化的抗體高2倍。經(jīng)嗜硫色譜、疏水色譜及凝膠層析等方法純化的抗體，尚含有一定的雜蛋白，有待進(jìn)一步優(yōu)化條件，以期得到純度更高的抗體。 4、經(jīng)雙向免疫擴(kuò)散法測定，所制抗眼鏡蛇毒IgY與眼鏡蛇、眼鏡王蛇反應(yīng)最明顯

10、，從反應(yīng)沉淀線上兩者無明顯區(qū)別，與眼鏡蛇科的其他蛇毒有相對較弱的交叉反應(yīng)；與國產(chǎn)圓斑蝰及緬甸蝰也有交叉反應(yīng)，與國產(chǎn)圓斑蝰的反應(yīng)強(qiáng)于緬甸蝰；與蝮蛇科大部分蛇毒無交叉反應(yīng)。與馬源性抗眼鏡蛇毒血清相比，免疫沉淀線在形態(tài)和數(shù)量上有一定的區(qū)別，可能與兩種抗體的特性有關(guān)?？寡坨R蛇毒IgY能與蝰蛇毒反應(yīng)，形成相對較弱的免疫沉淀線，而馬源性抗眼鏡蛇毒血清與蝰蛇毒反應(yīng)，無肉眼可見的免疫沉淀線形成。 5、通過免疫印跡反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)所制lgY與馬源性抗眼

11、鏡蛇毒血清在與眼鏡蛇毒的抗原反應(yīng)條帶方面存在一定的差別。 6、通過SDS-PAGE，測定所制IgY與眼鏡蛇毒的最佳反應(yīng)比(w/w)為2/2∶1，抗體在70℃以下活性穩(wěn)定，保持最佳活性的pH值是6～8，有效pH值范圍為3～12，與眼鏡蛇科的銀環(huán)蛇毒等有一定的交叉反應(yīng)，與緬甸蝰蛇毒及蝮蛇科的五步蛇毒等交叉反應(yīng)不明顯。 7、體外中和實(shí)驗(yàn)表明，7.44 mg的IgY抗體可以完全保護(hù)實(shí)驗(yàn)小鼠免受4倍LD<,50>眼鏡蛇毒的攻擊；同

12、時(shí)，雞血清中也保留著較高效價(jià)的抗體，可中和4倍LD<,50>以上的眼鏡蛇毒。 8、建立眼鏡蛇傷/IgY抗體保護(hù)模型，經(jīng)腹腔注入挑戰(zhàn)劑量(4倍LD<,50>：40.64mg/kg)的中華眼鏡蛇毒，人鼠平均生存時(shí)間為3±0.33h。蛇毒組給藥30～60min后，心率及呼吸頻率均有輕度加快，Ⅱ?qū)?lián)ST段抬升幅度超過同期正常對照0.1mV以上(P<0.05)；130～150min后，心率、呼吸頻率及動脈血壓均直線下降；達(dá)180min時(shí)，

13、心率、呼吸頻率及動脈血壓均已降到同期正常對照的30％以下，差異顯著(P<0.01)。IgY保護(hù)組給藥后各指標(biāo)相對平穩(wěn)，與對照組無明顯差別。蛇毒組心功能酶(CK、CK-mb)，肝功能酶(AST、Alt，Tbil)和腎功能(BUN、Cr-2、Ua)較IgY保護(hù)組和對照組都顯著增高(P<0.05)，而抗體保護(hù)組和對照組比較，變化不明顯(P>0.05)。 結(jié)論： 1、首次以眼鏡蛇毒粗毒免疫萊杭母雞，經(jīng)初次小劑量、間歇、逐漸加量加

14、強(qiáng)免疫，可持續(xù)40w獲得含有高效價(jià)、特異性抗體的雞卵。 2、發(fā)明的卵黃分離收集器可批量分離卵黃，在工業(yè)化生產(chǎn)IgY方面有較好的應(yīng)用前景。 3、經(jīng)水稀釋法粗提抗體，硫酸銨沉淀再聯(lián)合陰離予交換層析純化抗體，所得抗體純度較高，抗體活性好；經(jīng)水稀釋法粗提抗體，辛酸-硫酸銨沉淀純化的抗體，純度可達(dá)電泳純，抗體回收率高、活性好，純化方法經(jīng)濟(jì)、簡單易行，可與商業(yè)的純化試劑盒相媲美。 4、利用SDS-PAGE測定IgY的抗體特性