舟山眼鏡蛇毒細(xì)胞毒素CTXn的分離純化及其鎮(zhèn)痛作用研究.pdf

1、背景：蛇毒是由多種蛋白質(zhì)、多肽、酶類和其他小分子物質(zhì)組成的混合物。細(xì)胞毒素（cytotoxins，CTXs）和神經(jīng)毒素(neurotoxin，NT)和PLA2是其主要毒性成分。細(xì)胞毒素由60--63個氨基酸組成，空間結(jié)構(gòu)呈三指結(jié)構(gòu)，因其分子中由致密的內(nèi)核伸展出3個指狀肽鏈環(huán)而得名。蛇毒的成分復(fù)雜多樣，種屬之間變異很大。同一種屬，由于性別、年齡、或地域的不同，成分也會有所差別.Mukherjee AK[6]研究發(fā)現(xiàn)，印度相鄰三個地區(qū)的同種

2、眼鏡蛇毒，排除年齡，性別，季節(jié)的影響，其成分和生物活性仍存在很大差別。舟山眼鏡蛇主要分布于華南，臺灣、越南北部和老撾北部地區(qū)，明確其成分的地域性差異，對蛇毒的分離純化和蛇傷急救有實(shí)際應(yīng)用價值。
　　 神經(jīng)病理性疼痛常由外周或中樞的神經(jīng)損傷或功能紊亂引起。臨床主要表現(xiàn)為：痛反應(yīng)增強(qiáng)（hyperalgesia)、痛閾下降(allodynia)和自發(fā)性疼痛(spontaneous pain)。目前臨床上對神經(jīng)病理性疼痛還缺乏有效的藥物

3、治療，常用的鎮(zhèn)痛藥物主要是NSAIDs和阿片類藥物，但藥效的局限和不可避免的副作用限制了其應(yīng)用。因此，有必要尋找和開發(fā)新的有效減緩神經(jīng)病理性疼痛的藥物。外周神經(jīng)損傷的動物模型如，SNI,CCI,SNL等，能夠模擬神經(jīng)病理性疼痛的一些癥狀，對研究神經(jīng)病理性疼痛的機(jī)制和藥物開發(fā)提供了工具和載體。
　　 蛇毒鎮(zhèn)痛的研究與應(yīng)用已有很久的歷史。在上世紀(jì)初，已有報道從眼鏡蛇毒中分離出的神經(jīng)毒素cobrotoxin具有鎮(zhèn)痛作用。從響尾蛇毒中分

4、離出的crotalphine，通過κ-opioid受體，對CCI模型引起的痛敏，痛超敏和自發(fā)痛具有抑制作用。從響尾蛇毒中分離出的crotoxin，通過中樞煙堿受體和5-HT受體，對坐骨神經(jīng)瘤疼痛模型引起的神經(jīng)病理性疼痛具有鎮(zhèn)痛作用。細(xì)胞毒素的作用，則主要集中在心臟毒性，細(xì)胞凋亡，抗腫瘤，細(xì)胞毒性和抗血小板聚集。近期Dexian Donga和Jiang WJ報道了細(xì)胞毒素的鎮(zhèn)痛作用。相對于神經(jīng)毒素，細(xì)胞毒素由于其低毒性，顯示了廣闊的應(yīng)用前

5、景。研究細(xì)胞毒素的鎮(zhèn)痛及其作用機(jī)制已成為蛇毒鎮(zhèn)痛研究的新的方向。本實(shí)驗(yàn)擬探討蛇毒細(xì)胞毒素CTXn的鎮(zhèn)痛作用，為鎮(zhèn)痛藥物開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)支持。
　　 目的：運(yùn)用RP-HPLC比較大陸中南地區(qū)六省區(qū)的舟山眼鏡蛇毒的成分差異，選取CTX含量豐富的江西宜春地區(qū)的舟山眼鏡蛇蛇毒進(jìn)行分離純化和鎮(zhèn)痛組分初篩。經(jīng)過生化鑒定后，運(yùn)用急性疼痛模型和神經(jīng)病理性疼痛模型進(jìn)行鎮(zhèn)痛作用的評價，同時運(yùn)用微透析聯(lián)合RP-HPLC技術(shù)對其鎮(zhèn)痛作用機(jī)制作一初步探討。<

6、br>　　 方法：
　　 一、舟山眼鏡蛇毒細(xì)胞毒素的分離純化及鑒定
　　 1.中南地區(qū)蛇毒樣品的RP-HPLC分析
　　 收集中南地區(qū)六個省區(qū)的舟山眼鏡蛇毒樣本，經(jīng)采集處理后，運(yùn)用RP-HPLC技術(shù)進(jìn)行蛇毒成分的含量的地域性差異分析。
　　 2.舟山眼鏡蛇毒的分離純化及成分鑒定
　　 舟山眼鏡蛇蛇毒的分離純化采用Sephadex G-75層析和離子交換層析兩步法進(jìn)行。將分離后的蛇毒各組分進(jìn)行鎮(zhèn)痛

7、作用初篩。選取有效成分作進(jìn)一步純度分析和MALDI-TOF質(zhì)譜及蛋白質(zhì)序列測定。
　　 二．CTXn的毒性及鎮(zhèn)痛活性測定
　　 1.毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)
　　 Bliss法檢測其LD50毒性，運(yùn)用藥物耐受性模型、間接 ELISA 檢測和條件性位置偏愛(CPP）實(shí)驗(yàn)、大鼠催促戒斷實(shí)驗(yàn)和自然戒斷實(shí)驗(yàn)測定CTXn的藥物耐受性和依賴性。
　　 2.急性疼痛實(shí)驗(yàn)
　　 運(yùn)用熱板實(shí)驗(yàn)和醋酸扭體實(shí)驗(yàn)測定CTXn對生理性疼

8、痛的鎮(zhèn)痛作用。
　　 3.神經(jīng)病理性疼痛實(shí)驗(yàn)
　　 運(yùn)用大鼠脊神經(jīng)結(jié)扎(SNL)模型測定CTXn對機(jī)械刺激痛敏和熱刺激痛敏的抑制作用；并用非特異性阿片受體拮抗劑納洛酮和膽堿能受體拮抗劑阿托品測定其對CTXn鎮(zhèn)痛作用的影響。
　　 4.動物自主活動測試曠場實(shí)驗(yàn)
　　 檢測CTXn對動物自主活動的影響。
　　 三．微透析技術(shù)檢測CTXn對脊髓水平單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的調(diào)控
　　 1.采用脊髓微透析技

9、術(shù)聯(lián)合HPLC-ECD技術(shù)
　　 實(shí)時動態(tài)采集脊髓背角部位的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)去甲腎上腺素(NA)和5-羥色胺（5-HT）進(jìn)行定量分析，測定其NA和5-HT的含量變化及CTXn對其含量的影響。
　　 2.測定納洛酮和阿托品干預(yù)對CTXn引起NA和5-HT含量變化的影響。
　　 四．統(tǒng)計(jì)分析
　　 采用t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)，SPSS軟件等統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
　　 結(jié)果：
　　 1.運(yùn)用RP-HPLC

10、比較中南六省區(qū)的舟山眼鏡蛇毒成分差別，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各地蛇毒樣品中所含主要成分相同，但各成分的含量存在很大差異。CTXn在江西宜春地區(qū)的含量最高，在廣西元寶山地區(qū)則沒有發(fā)現(xiàn)這種成分。
　　 2.運(yùn)用Sephadex G-75層析和離子交換層析兩步法對舟山眼鏡蛇蛇毒進(jìn)行分離純化。分離效果良好，分離組分的純度可達(dá)95％以上。
　　 3.蛇毒成分的鎮(zhèn)痛初篩和理化性質(zhì)鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所分離出的成分中，CTXn的鎮(zhèn)痛效果較好，治療指數(shù)高。

11、
　　 4.CTXn的小鼠腹腔注射的LD50為19.61±2.05mg/kg.CTXn長期腹腔給藥易導(dǎo)致藥物耐受，腹腔給藥期間ELISA檢測有抗體產(chǎn)生。CTXn鞘內(nèi)給藥不存在藥物耐受。條件性位置偏愛(CPP）實(shí)驗(yàn)、大鼠催促戒斷實(shí)驗(yàn)和自然戒斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明長期給予CTXn不會產(chǎn)生藥物依賴性。
　　 5.熱板實(shí)驗(yàn)和醋酸扭體實(shí)驗(yàn)測定，不同劑量的CTXn(0.50mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg.ip.)對生理性疼痛

12、有良好鎮(zhèn)痛作用，且具劑量依賴性。
　　 6.神經(jīng)病理性疼痛實(shí)驗(yàn)測定，CTXn（0.50mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg.ip.）對SNL引起的機(jī)械刺激痛敏和熱刺激痛敏有抑制作用；其鎮(zhèn)痛作用可被納洛酮翻轉(zhuǎn)，但阿托品對此無影響。
　　 7.曠場實(shí)驗(yàn)檢測，結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)劑量的CTXn對動物自主活動無影響。
　　 8.脊髓微透析聯(lián)合HPLC-ECD技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，CTXn可促進(jìn)SNL模型動物脊髓背角去甲腎上腺素

13、(NA)和5-羥色胺（5-HT）的分泌增加。納洛酮可逆轉(zhuǎn)此作用。
　　 結(jié)論：
　　 1.中南六省區(qū)的舟山眼鏡蛇毒成分存在地域性差異。地域相近的蛇毒成分含量較為接近。
　　 2.運(yùn)用Sephadex G-75層析和離子交換層析兩步法分離純化眼鏡蛇蛇毒，分離效果好，純度高。
　　 3.CTXn長期系統(tǒng)給藥，易導(dǎo)致藥物耐受，可能與抗體的產(chǎn)生及中和作用有關(guān)。CTXn長期應(yīng)用不會產(chǎn)生依賴性。
　　 4.C