中華眼鏡蛇毒成分CⅡ-3-1分離純化及對多藥耐藥K562-A02細(xì)胞作用的研究.pdf

1、背景：腫瘤是嚴(yán)重危害人類健康的一類惡性疾病，化學(xué)治療是其主要治療方法之一，而化療中腫瘤細(xì)胞多藥耐藥是腫瘤患者死亡的主要原因，目前，對腫瘤耐藥的分子機制和治療已取得了相當(dāng)?shù)某删停@些還遠(yuǎn)不能圓滿解釋腫瘤多藥耐藥的發(fā)生機理。臨床上治療多藥耐藥腫瘤的藥物寥寥無幾。因此，尋找新的耐藥相關(guān)分子和治療新途徑和新藥物，已成為腫瘤研究的熱點。 目的：本課題通過由蛇毒粗毒中尋找抗腫瘤組分(CⅡ-3-1)，為中華眼鏡蛇毒組分(CⅡ-3-1)的抗腫

2、瘤作用機理奠定基礎(chǔ)，然后研究中華眼鏡蛇毒組分CⅡ-3-1抗腫瘤多藥耐藥作用及機制。 方法：一、中華眼鏡蛇毒組分的分離純化、鑒定、毒性及其抗腫瘤篩選研究 1.分離、純化、鑒定及毒性研究應(yīng)用凝膠層析法對眼鏡蛇毒組分CⅡ進行分離純化，采用SephadexG-75，SephadexG-25通過AKTAexplorer100蛋白快速純化儀分別進行分離和脫鹽，然后凍干保存HPLC分析鑒定層析組分以及蛇毒CⅡ和CⅡ-3-1的LD50測

3、定。 2.抗腫瘤活性篩選應(yīng)用MTT法進行蝎毒各分離組分的抗腫瘤篩選工作，主要觀察對人肺癌A549細(xì)胞、人早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞HL-60、人紅白血病細(xì)胞敏感株K562和人紅白血病細(xì)胞耐藥株K562/A02的殺傷作用。 二、中華眼鏡蛇毒組分CⅡ-3-1抗腫瘤多藥耐藥作用及機制。 1.應(yīng)用MTT法對比研究CⅡ-3-1對K562和K562/A02單用及聯(lián)合阿霉素體外的抑制增殖作用。 2.應(yīng)用流式細(xì)胞儀染色法檢測中

4、華眼鏡蛇毒組分CⅡ-3-1誘導(dǎo)K562/A02細(xì)胞的凋亡作用。 3.采用流式細(xì)胞儀法分析中華眼鏡蛇毒組分CⅡ-3-1對K562/A02細(xì)胞的P-gp蛋白功能的影響。 結(jié)果：1.中華眼鏡蛇毒經(jīng)過SephadexG-75分離、SephadexG-25脫鹽后得10個組分。HPLC結(jié)果顯示出顯示出CⅡ-3-1主要由1個峰構(gòu)成，相對純度為52.35％。蛇毒粗毒及組分CⅡ-3-1的LD50分別為0.602mg/kg、0.622mg/

5、kg。蛇毒組分CⅡ-3-1的毒性與蝎毒粗毒強差別不大，該結(jié)果表明，蝎毒粗毒經(jīng)過純化后，其有效成分CⅡ-3-1毒性可以完全保存。 2.中華眼鏡蛇毒組分CⅡ-3-1單用對多藥耐藥細(xì)胞K562/A02及敏感細(xì)胞K562都有很強的殺傷作用。 3.流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)1.25、2.5、5ug/ml濃度中華眼鏡蛇毒組分CⅡ-3-1作用K562/A02細(xì)胞3小時后，細(xì)胞調(diào)亡率分別為10.6±2.17、18.8±2.99、48.5±4.0

6、5，隨著作用時間增加，調(diào)亡率也增加。 4.中華眼鏡蛇毒組分CⅡ-3-1可以抑制多藥耐藥細(xì)胞K562/A02內(nèi)Rh-123的外排。 結(jié)論：蛇毒粗毒經(jīng)過SephadexG-75、SephadexG-25柱可分離到10個組分，組分Ⅲ經(jīng)SephadexG-25柱脫鹽又可分離為峰1～3，其中峰1為CⅡ-3-1，并發(fā)現(xiàn)在所有組分中，中華眼鏡蛇毒組分CⅡ-3-1的抗腫瘤作用最強。中華眼鏡蛇毒組分CⅡ-3-1對多藥耐藥白血病細(xì)胞K562