異硫氰酸苯乙酯對(duì)K562-A02細(xì)胞耐藥逆轉(zhuǎn)的研究.pdf

1、目的:本課題旨在研究異硫氰酸苯乙酯（phenylhexyl isothiocyanate，PHI）單獨(dú)及聯(lián)合阿霉素（Adriamycin，ADM）對(duì)人慢性粒細(xì)胞白血病急性紅白血病變細(xì)胞株K562及其耐藥細(xì)胞株K562/A02作用及其機(jī)制，同時(shí)研究PHI對(duì)K562/A02細(xì)胞ADM耐藥性與敏感性的影響，為PHI的進(jìn)一步研究及臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。 方法:（1）采用甲基四唑藍(lán)法（MTT）法檢測(cè)PHI、PHI+ADM和ADM分別作用于

2、K562/A02細(xì)胞和K562細(xì)胞24、48和72h對(duì)細(xì)胞的增殖影響，計(jì)算出其半數(shù)抑制量（50％Inhibiting Concentration， IC50）、逆轉(zhuǎn)倍數(shù)（Fold Reversal，F(xiàn)R）；（2）采用流式細(xì)胞儀（Flow Cytometry， FCM）檢測(cè)不同濃度PHI對(duì)K562細(xì)胞和K562/A02細(xì)胞的周期和凋亡，以及PHI與1μg/ml ADM聯(lián)合運(yùn)用時(shí)細(xì)胞內(nèi)ADM濃度的變化；（3）分光光度儀（Spectromet

3、ric enzyme assay）測(cè)定PHI作用前后細(xì)胞內(nèi)還原性谷胱甘肽（GSH）含量的變化；（4）采用FCM檢測(cè)PHI單藥作用前后P糖蛋白1（P-gp1）和多藥耐藥性相關(guān)蛋白1（MRP1）的變化；（5）采用半定量PCR（RT-PCR）測(cè)定細(xì)胞P-gp1、MRP1 mRNA表達(dá)變化。 結(jié)果:（1）PHI對(duì)K562、K562/A02細(xì)胞的作用有濃度和時(shí)間依賴性。其中，PHI48h作用K562/A02、K562的IC50分別為（64

4、.3±3.83）μmol/l和（63.5±3.93）μmol/l，兩者間無(wú)顯著差異（p>0.05）； ADM作用48h對(duì)K562/A02、K562細(xì)胞的IC50值分別為（57.43±4.55）μg/ml和（1.16±0.05）μg/ml，K562/A02對(duì)ADM的耐藥倍數(shù)為49.51倍；PHI+ADM合用組，PHI≥10μmol/l時(shí)，ADM對(duì)兩組細(xì)胞的IC50均下降（p<0.05），當(dāng)PHI≥20μmol/l其耐藥FR變化差異顯著（p

5、<0.05）。（2）FCM檢測(cè)顯示①當(dāng)0μmol/l PH1作用于K562/A02細(xì)胞G1期占（30.65±0.92）％，40μmol/l時(shí)G1期占（47.49±0.93）％，隨著PHI的濃度增加K562/A02細(xì)胞周期G1期比例增加。②對(duì)照組K562/A02細(xì)胞48h凋亡率為（1.83±0.35）％；1μg/ml的ADM單獨(dú)作用于K562/A02細(xì)胞凋亡率為（1.87±0.39）％，ADM與PHI聯(lián)合使用后K562/A02細(xì)胞的凋亡隨

6、著PHI濃度的增加而增加。③1μg/ml ADM作用K562/A02細(xì)胞48h，細(xì)胞內(nèi)ADM平均熒光強(qiáng)度為（87.00±4.64），當(dāng)加入≥20μmol/lPHI的濃度時(shí)，K562/A02細(xì)胞內(nèi)ADM藥物濃度增加有顯著差異（P<0.05）。（3）分光光度儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：K562/A02細(xì)胞與K562細(xì)胞中GSH的濃度之比為1.8，顯示耐藥株腫瘤細(xì)胞內(nèi)較高的GSH濃度。單獨(dú)運(yùn)用1μg/ml ADM作用48h K562/A02細(xì)胞內(nèi)的GSH含量

7、下降5％；單獨(dú)PHI作用48h K562/A02細(xì)胞內(nèi)的GSH含量隨著PHI濃度的增加先是輕度升高后下降，GSH含量下降點(diǎn)在PHI為10μmol/l時(shí)；當(dāng)PHI≥20μmol/l與1μg/mlADM聯(lián)合運(yùn)用48h時(shí)，K562/A02細(xì)胞內(nèi)的GSH含量隨著PHI濃度的升高進(jìn)行性下降。（4）FCM測(cè)定K562/A02細(xì)胞膜P-gp1的值為（98.28±1.71）％，K562細(xì)胞P-gp1為（0.60±0.21）％，兩者有明顯差異（P<0.0

8、5）。加入不同濃度的PHI作用48h，當(dāng)PHI≥40μmol/l時(shí)，K562/A02細(xì)胞膜P-gp1表達(dá)下降出現(xiàn)差異（P<0.05）。K562/A02細(xì)胞、K562細(xì)胞MRP1分別為（98.81±1.72）％和（98.43±1.71）％，兩者無(wú)明顯差異（P>0.05）。（5）RT-PCR檢測(cè)顯示K562細(xì)胞MDR1 mRNA表達(dá)為陰性，K562/A02細(xì)胞MDR1 mRNA表達(dá)為陽(yáng)性；相應(yīng)的MDR1/β-action灰度值下降亦在PHI

9、≥40μmol/l時(shí)出現(xiàn)差異（P<0.05）；兩細(xì)胞株之間的MRP1 mRNA無(wú)差異（p>0.05），而不同濃度PHI作用于K562/A02細(xì)胞MRP1 mRNA變化亦無(wú)差異（p>0.05）。 結(jié)論:（1）PHI對(duì)K562/A02細(xì)胞有時(shí)間、劑量依賴性的細(xì)胞毒作用，其作用與細(xì)胞內(nèi)GSH耗竭無(wú)線性關(guān)系。（2）聯(lián)合使用PHI可減少ADM的用量，而降低其毒副作用。（3）PHI不但可以增強(qiáng)K562/A02細(xì)胞對(duì)ADM的敏感性，而且具有一