川芎嗪茋類衍生物對(duì)K562-A02細(xì)胞的耐藥逆轉(zhuǎn)作用及機(jī)制研究.pdf

1、腫瘤是威脅人類健康的主要疾病之一，化學(xué)藥物為其治療的重要手段，但腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性是影響化療治療效果的重要原因之一。MDR的產(chǎn)生是多種基因產(chǎn)物共同作用的結(jié)果。目前認(rèn)為多藥耐藥性形成的原因主要有ATP結(jié)合膜糖蛋白如P-糖蛋白(P-glyeoprotein,P-gp)的過(guò)表達(dá)或活性升高，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶或蛋白激酶C的表達(dá)、活性增加，DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ的水平下降或性質(zhì)改變以及抗凋亡蛋白的高表達(dá)，均可使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐受性。
　　 川

2、芎嗪是中藥川芎的主要有效成分之一，已有很多文獻(xiàn)報(bào)道它具有逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥的活性，是中藥拮抗腫瘤多藥耐藥的熱點(diǎn)化合物之一。但川芎嗪分子中的甲基易被氧化，生成極性和水溶性較大的代謝物而被迅速排出體外，所以川芎嗪存在半衰期短，生物利用度低等缺點(diǎn)。經(jīng)川芎嗪及其衍生物構(gòu)效關(guān)系研究，證實(shí)吡嗪環(huán)為其基本藥效基團(tuán)；2，3，5，6位甲基為藥代基團(tuán)。芪類衍生物具有逆轉(zhuǎn)多藥耐藥、抗腫瘤細(xì)胞侵襲、黏附等廣泛的抗腫瘤活性，其代表化合物白藜蘆醇抗腫瘤活性已被科學(xué)界

3、所認(rèn)可。因此，以白黎蘆醇為結(jié)構(gòu)模型，在保持其基本骨架不變的前提下，以吡嗪環(huán)替代其中一個(gè)苯環(huán)，即在川芎嗪側(cè)鏈上引入取代苯乙烯基，設(shè)計(jì)合成了一系列川芎嗪芪類衍生物。以白藜蘆醇的活性基團(tuán)取代川芎嗪分子的藥代基團(tuán)，以期克服川芎嗪體內(nèi)半衰期短、生物利用度低等缺點(diǎn)，并通過(guò)協(xié)同作用增強(qiáng)藥效，提高腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)效果。在本課題中，對(duì)合成的該系列川芎嗪芪類衍生物進(jìn)行了活性篩選，并對(duì)其中具有較好逆轉(zhuǎn)活性的DLJ14在阿霉素白血病耐藥株K562/A02中的多

4、藥耐藥逆轉(zhuǎn)作用及其可能機(jī)制進(jìn)行了研究。
　　 在本課題中，首先采用MTT(溴化-(4，5)-二甲基-2-噻唑基－2，5－二苯基四噻唑）法檢測(cè)K562/A02耐藥倍數(shù)、化合物逆轉(zhuǎn)活性以及化合物自身的細(xì)胞毒性作用。利用阿霉素的自發(fā)熒光測(cè)定K562/A02及K562細(xì)胞內(nèi)阿霉素蓄積情況。
　　 對(duì)化合物DLJ14體外逆轉(zhuǎn)MDR作用機(jī)制的研究，首先考察對(duì)P-gp耐藥途徑的影響。采用羅丹明123自發(fā)熒光測(cè)定方法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)羅丹明12

5、3的蓄積，考察DLJ14對(duì)P-gp外排泵功能的影響；采用熒光素.熒光素酶法分析K562/A02及K562細(xì)胞中ATP含量，考察DLJ14對(duì)P-gp能量依賴性的影響；采用無(wú)機(jī)磷釋放法觀察DLJ14對(duì)ATPase活性的影響；采用western blot法和Realtime-PCR法觀察DLJ14對(duì)K562/A02細(xì)胞內(nèi)P-gp的蛋白表達(dá)及其mRNA水平的影響。
　　 其次，考察化合物DLJ14對(duì)GST耐藥途徑的影響。利用GST和GP

6、X可以催化GSH與1-氯-2，4-二硝基苯(CDNB)生成帶顏色的化合物，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其吸光度值檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)GST、GPX活性及GSH水平。用western blot和Realtime-PCR法檢測(cè)DLJ14對(duì)K562/A02及K562細(xì)胞GST蛋白表達(dá)及其mRNA水平的影響。同樣采用western blot法檢測(cè)DLJ14對(duì)兩種細(xì)胞內(nèi)c-jun氨基末端激酶(JNK)及其磷酸化形式(p-JNK)表達(dá)的影響。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

7、如下：
　　 一、川芎嗪芪類衍生物逆轉(zhuǎn)耐藥活性篩選
　　 K562/A02和K562細(xì)胞對(duì)阿霉素(Adr)的IC50分別是4.66±0.27μmol/L，0.035±0.009 umol/L，耐藥倍數(shù)為133.3倍，具有穩(wěn)定的耐藥性；對(duì)24個(gè)川芎嗪芪類衍生物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)多藥耐藥活性篩選，其中DLJ14、DLJ21及DLJ29表現(xiàn)出較好的逆轉(zhuǎn)活性，20μmol/L濃度時(shí)逆轉(zhuǎn)倍數(shù)分別為22.46，7.28及9.16。DLJ14對(duì)

8、K562/A02及K562細(xì)胞的毒性作用均較弱，20μmol/L濃度作用120h對(duì)兩種細(xì)胞的抑制率分別為27.20％，28.56％，而10μmol/L VP則為48.70％及41.70％。在測(cè)定阿霉素的蓄積實(shí)驗(yàn)中，未加藥處理的K562/A02細(xì)胞中阿霉素的濃度僅為K562細(xì)胞的42.3％，而在加入DLJ14處理之后，兩種細(xì)胞中的阿霉素蓄積均顯著增加并呈現(xiàn)劑量依賴性。
　　 二、DLJ14對(duì)P-gp外排泵的逆轉(zhuǎn)耐藥機(jī)制研究

9、　　 對(duì)P-gp耐藥途徑的研究中，首先測(cè)定了細(xì)胞內(nèi)羅丹明123的蓄積。在未加藥處理之前，K562/A02細(xì)胞中羅丹明123的濃度僅為K562細(xì)胞的33.64％，而在加入具有逆轉(zhuǎn)活性的DLJ14之后，K562/A02細(xì)胞中的羅丹明123蓄積顯著增加并呈現(xiàn)劑量依賴性，而K562細(xì)胞中羅丹明123濃度無(wú)明顯變化。通過(guò)無(wú)機(jī)磷釋放法測(cè)定細(xì)胞中ATP酶活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示耐藥株K562/A02細(xì)胞中ATPase活性高于敏感株K562細(xì)胞，10，20

10、 umol/L DLJ14可以顯著降低K562/A02細(xì)胞中的ATPase活性。而各濃度的DLJ14對(duì)K562中ATPase活性基本沒(méi)有影響。另外，在通過(guò)熒光素-熒光素酶法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ATP含量的實(shí)驗(yàn)中，DLJ14(2.5，5，10，20μmol/L)可不同程度地降低K562/A02細(xì)胞內(nèi)ATP水平，但對(duì)K562細(xì)胞內(nèi)ATP水平的影響程度較弱。Western blot結(jié)果顯示，K562/A02細(xì)胞內(nèi)P-gp有較強(qiáng)表達(dá)，而K562細(xì)胞內(nèi)則無(wú)

11、P-gp表達(dá)。DLJ14對(duì)K562/A02細(xì)胞中P-gp表達(dá)無(wú)明顯影響。Realtime-PCR法檢測(cè)P-gp mRNA水平，結(jié)果顯示K562細(xì)胞中Mdr1基因mRNA表達(dá)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于K562/A02細(xì)胞，而高濃度劑量20μmol/L DLJ14可以少量降低Mdr1基因mRNA表達(dá)水平，其余低劑量DLJ14則無(wú)顯著作用，其差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 三、DLJ14對(duì)GST相關(guān)通路的逆轉(zhuǎn)耐藥機(jī)制研究
　　 對(duì)GSTπ相關(guān)

12、通路的逆轉(zhuǎn)耐藥機(jī)制的研究中，耐藥株K562/A02細(xì)胞中的GST，GPX活性顯著高于K562細(xì)胞。在經(jīng)過(guò)5，10，20μmol/L DLJ14處理K562/A02細(xì)胞72h后，GST活性分別降低3.26％，11.57％及20.77％，而GPX活性分別降低18.80％，32.83％及42.61％，具有劑量依賴性。而K562/A02細(xì)胞內(nèi)GSH水平低于K562細(xì)胞，經(jīng)5，10，20μmol/L Did14處理后K562/A02細(xì)胞內(nèi)GSH含

13、量升高，分別增加4.86％，18.69％及31.59％。用Western blot方法測(cè)定GSTπ蛋白表達(dá)水平，DLJ14可以顯著減少K562/A02及K562細(xì)胞中GST蛋白表達(dá)。同時(shí)用Realtime-PCR檢測(cè)GST基因表達(dá)mRNA水平，經(jīng)2.5μmol/LDLJ14處理K562/A02及K562細(xì)胞72h后，可顯著降低細(xì)胞內(nèi)GST基因mRNA水平，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。單用DLJ14(2.5，20μmol/L)處理K562/A02

14、及K562細(xì)胞72h后，測(cè)定細(xì)胞內(nèi)JNK及p-JNK表達(dá)，各組中JNK蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯差異，而20μmaol/L DLJ14可以略微增加p-JNK的表達(dá)。將DLJ14(2.5，20μmol/L)與Adr(10μmol/L)合用處理K562/A02及K562細(xì)胞72h后，測(cè)定其中的p-JNK表達(dá)，各組中p-JNK蛋白表達(dá)水平明顯增加。
　　 本課題篩選出了具有良好逆轉(zhuǎn)活性的川芎嗪芪類衍生物DLJ14，它可通過(guò)抑制P-gp功能和調(diào)