多肽殼聚糖川芎嗪納米粒逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥作用研究.pdf

1、目的:
　　合成多肽偶聯(lián)殼聚糖，制備多肽殼聚糖川芎嗪納米粒(pEGF-CS-TMP-NPs)，初步研究其逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥作用與機(jī)制。
　　方法:
　　1.以谷胱甘肽為偶聯(lián)劑，通過(guò)酰胺反應(yīng)制備巰基殼聚糖，優(yōu)化巰基殼聚糖制備工藝。通過(guò)分子內(nèi)二硫鍵的形式將表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)特異性配體多肽(pEGF)修飾于巰基殼聚糖表面，從而合成多肽偶聯(lián)殼聚糖。紅外光譜、核磁共振光譜分析產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)表征。
　　2.離子交聯(lián)法

2、制備pEGF-CS-TMP-NPs，透射電鏡觀察pEGF-CS-TMP-NPs的形態(tài)，激光粒度分析儀測(cè)定粒徑、分散度、Zeta電位，高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定包封率、載藥量。
　　3.選擇EGFR高表達(dá)的人乳腺癌耐藥細(xì)胞(MCF-7/ADR)和EGFR陰性表達(dá)的人白血病耐藥細(xì)胞(K562/ADR)作為細(xì)胞模型，MTT法測(cè)定細(xì)胞的耐藥倍數(shù)。兩種耐藥細(xì)胞分別給予0.10、1.00、10.00、50.00、100.00μmol·L-

3、1的阿霉素，相應(yīng)的敏感細(xì)胞分別給予0.05、0.10、0.50、1.00、10.00μmol·L-1的阿霉素，給藥處理48h，加入MTT，隨后用酶標(biāo)儀于492nm處檢測(cè)吸光度值，計(jì)算各給藥組細(xì)胞存活率，利用計(jì)算機(jī)Origin軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別計(jì)算四種細(xì)胞的IC50，并計(jì)算出耐藥倍數(shù)。
　　4.MTT法檢測(cè)pEGF-CS-TMP-NPs的細(xì)胞毒作用。選取耐藥細(xì)胞MCF-7/ADR和K562/ADR，分別加入0.03、0.06、0

4、.12、0.25、0.50μg·mL-1的多肽殼聚糖川芎嗪納米粒(pEGF-CS-TMP-NPs)。給藥處理48 h，加入MTT，隨后用酶標(biāo)儀于492nm處檢測(cè)吸光度值，采用Origin軟件分別計(jì)算兩種耐藥細(xì)胞的IC95（細(xì)胞存活率為95％時(shí)的藥物濃度）、IC90（細(xì)胞存活率為90％時(shí)的藥物濃度）、IC85（細(xì)胞存活率為85％時(shí)的藥物濃度）和IC80（細(xì)胞存活率為80％時(shí)的藥物濃度）。
　　5.選取MCF-7/ADR、K562/A

5、DR兩種細(xì)胞，每種細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)給藥分組分為四組，第一組分別給予不同濃度的pEGF-CS-TMP-NPs(0.03125、0.0625、0.125、0.25μg·mL-1)和阿霉素(1μg·mL-1)，第二組單純給予阿霉素(1μg·mL-1)，第三組單純給予pEGF-CS-TMP-NPs(0.0625μg·mL-1)，第四組為空白組，只加入培養(yǎng)基和細(xì)胞。給藥后常規(guī)培養(yǎng)48 h后，酶標(biāo)儀于492nm處檢測(cè)吸光度值。計(jì)算兩種細(xì)胞各組的細(xì)胞存活率

6、。
　　6.MTT法測(cè)定逆轉(zhuǎn)前后阿霉素耐藥指數(shù)測(cè)定。選擇MCF-7/ADR、K562/ADR兩種耐藥細(xì)胞，每種細(xì)胞分為兩組，分別給予pEGF-CS-TMP-NPs的無(wú)毒劑量IC95、IC85，給藥24h后，分別加入不同濃度阿霉素（0、0.1、1.0、10.0、50.0、100.0μmol·L-1），繼續(xù)培養(yǎng)至48h，酶標(biāo)儀于492nm處檢測(cè)吸光度值。計(jì)算各給藥組細(xì)胞存活率，利用計(jì)算機(jī)Origin軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別計(jì)算兩種細(xì)胞的

7、IC50，并計(jì)算出逆轉(zhuǎn)指數(shù)。逆轉(zhuǎn)指數(shù)=逆轉(zhuǎn)前IC50/逆轉(zhuǎn)后IC50。
　　7.Western Blotting法檢測(cè)細(xì)胞耐藥相關(guān)蛋白P-gp和EGFR的表達(dá)水平。選擇MCF-7、MCF-7/ADR、K562、K562/ADR四種細(xì)胞，IP裂解液提取胞膜總蛋白，檢測(cè)細(xì)胞中P-gp和EGFR表達(dá)情況，并以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算P-gp和EGFR的表達(dá)水平。
　　8.Western Blotting法檢測(cè)P-gp表達(dá)水平。選

8、擇MCF-7/ADR和K562/ADR細(xì)胞，分別給予IC95、IC90、IC85三個(gè)濃度的pEGF-CS-TMP-NPs，給藥后48h提取蛋白，利用Western Blotting法檢測(cè)兩種耐藥細(xì)胞在不同濃度分組下的P-gp表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　1.合成巰基殼聚糖。紅外掃描圖譜顯示殼聚糖與巰基殼聚糖在3425cm-1都有-NH2和-OH的伸縮震動(dòng)峰，而巰基殼聚糖在1626cm-1、1516cm-1新出現(xiàn)C=O和C-N的

9、伸縮振動(dòng)峰。核磁圖譜顯示，巰基殼聚糖新增加三個(gè)位移值，分別為三個(gè)亞甲基的位移，δ2.7是與-SH相鄰的兩個(gè)亞甲基，δ1.3是與亞胺基相鄰的亞甲基，表明巰基已經(jīng)連接到殼聚糖表面。經(jīng)過(guò)對(duì)巰基殼聚糖合成工藝優(yōu)化發(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH=6.0且反應(yīng)物巰基殼聚糖、谷胱甘肽、1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽與N-羥基丁二酰亞胺的質(zhì)量比為1∶1∶3∶1.5時(shí)，合成的巰基殼聚糖的巰基含量最高。對(duì)比合成的多肽偶聯(lián)殼聚糖與殼聚糖的核磁圖譜，結(jié)果可見在

10、δ7.0，δ6.8，δ6.7處新增加三個(gè)位移值，經(jīng)過(guò)分析可知此為氨基酸中的芳香氫，說(shuō)明pEGF已成功偶聯(lián)到殼聚糖分子表面。
　　2.激光粒度儀測(cè)定納米粒的結(jié)果:粒徑為150.50+9.3nm，分散度(PDI)為0.059±0.007，Zeta電位為19.30±2.02mv。透射電鏡下觀察，納米粒形態(tài)大部分成球形，分散度良好。采用HPLC法測(cè)得多肽殼聚糖納米粒的包封率為37.66±0.53％，載藥量為3.25±0.34％。
　

11、　3.采用MTT法檢測(cè)并計(jì)算各給藥組細(xì)胞存活率，利用計(jì)算機(jī)Origin軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出MCF-7、MCF-7/ADR、K562、K562/ADR細(xì)胞的IC50分別為0.703、65.78、0.93、＞100μmol·L-1。從而計(jì)算出MCF-7/ADR的耐藥倍數(shù)為93.5倍，K562/ADR的耐藥倍數(shù)大于100倍。
　　4.pEGF-CS-TMP-NPs對(duì)MCF-7/ ADR和K562/ ADR細(xì)胞的細(xì)胞毒作用均較小。且在

12、納米粒為低濃度時(shí)，即納米粒濃度為0.06、0.12、0.25μg·mL-1，對(duì)MCF-7/ADR的敏感性高于K562/ADR，這可能與納米粒的主動(dòng)靶向性相關(guān)。當(dāng)納米粒濃度增加至0.50μg.mL-1時(shí)，兩者細(xì)胞對(duì)納米粒的敏感性未見明顯差異。pEGF-CS-TMP-NPs作用于MCF-7/ADR細(xì)胞的IC95、IC90、IC85和IC80分別為0.03、0.08、0.16、0.24μg.mL-1，作用于K562/ADR細(xì)胞的IC95、IC

13、90、 IC85、IC80分別為0.08、0.16、0.24、0.30μg.mL-1。
　　5.pEGF-CS-TMP-NPs聯(lián)合阿霉素作用于兩種細(xì)胞時(shí)，與單獨(dú)給予阿霉素比較，pEGF-CS-TMP-NPs聯(lián)合阿霉素給藥能夠顯著降低兩種耐藥細(xì)胞存活率，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，存在顯著性差異，表現(xiàn)出對(duì)阿霉素抗腫瘤作用的增敏作用，而且該作用與聯(lián)合pEGF-CS-TMP-NPs的濃度成正相關(guān)。其中對(duì)EGFR陽(yáng)性表達(dá)的MCF-7/ADR細(xì)胞的敏感性

14、明顯高于EGFR陰性表達(dá)的K562/ADR，這與pEGF-CS-TMP-NPs的主動(dòng)靶向性有關(guān)。
　　6.將pEGF-CS-TMP-NPs的IC95作為給藥濃度時(shí)，兩種耐藥細(xì)胞MCF-7/ADR和K562/ADR的逆轉(zhuǎn)指數(shù)分別為1.21和1.31，逆轉(zhuǎn)指數(shù)無(wú)明顯差異;而將pEGF-CS-TMP-NPs的IC85作為給藥濃度時(shí)，MCF-7/ADR和K562/ADR的逆轉(zhuǎn)指數(shù)分別為3.68和1.87，逆轉(zhuǎn)指數(shù)存在明顯差異。顯示pEGF

15、-CS-TMP-NPs對(duì)耐藥細(xì)胞MCF-7/ADR的敏感性明顯高于對(duì)耐藥細(xì)胞K562/ADR的敏感性。
　　7.Western Blotting結(jié)果顯示P-gp在兩種耐藥細(xì)胞MCF-7/ADR和K562/ADR中均高表達(dá)，而在細(xì)胞MCF-7和K562中為陰性表達(dá);EGFR在細(xì)胞MCF-7和MCF-7/ADR中為陽(yáng)性表達(dá)，而在細(xì)胞K562和K562/ADR細(xì)胞中為陰性表達(dá)。其中EGFR在細(xì)胞MCF-7/ADR中的表達(dá)水平明顯高于在細(xì)

16、胞MCF-7中的表達(dá)。
　　8.兩種耐藥細(xì)胞給予pEGF-CS-TMP-NPs作用后，Western Blotting檢測(cè)P-gp表達(dá)情況。結(jié)果顯示，P-gp在EGFR陽(yáng)性表達(dá)的MCF-7/ADR細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯下降，而在EGFR陰性表達(dá)的K562/ ADR細(xì)胞中的表達(dá)量無(wú)明顯變化?？梢耘袛鄍EGF-CS-TMP-NPs逆轉(zhuǎn)腫瘤MDR的機(jī)制與下調(diào)腫瘤耐藥相關(guān)蛋白P-gp相關(guān)。
　　結(jié)論:
　　本實(shí)驗(yàn)采用低毒、價(jià)格低