葉酸修飾川芎嗪納米粒體內外靶向特征及增強腫瘤轉移抑制作用研究.pdf

1、目的:
　　優(yōu)化葉酸殼聚糖川芎嗪納米粒(主動靶向納米粒，F(xiàn)A-CS-LZ-NPs)的制備工藝，考察其體內外靶向特征，探討其抑制腫瘤轉移作用與機制。
　　方法:
　　1.主動靶向納米粒制備和處方、工藝優(yōu)化。離子交聯(lián)法制備主動靶向納米粒，選取葉酸殼聚糖(FA-CS)濃度、多聚磷酸鈉(TPP)濃度、pH值為主要影響因素，以包封率、載藥量、粒徑作為評價指標，采用Box-Behnken實驗設計對納米粒處方和工藝進行優(yōu)化。

2、　　2.主動靶向納米粒體外靶向性考察。Western Blotting法檢測細胞葉酸受體表達水平，篩選細胞用于下一步試驗。MTT法檢測主動靶向納米粒的細胞毒性，確定給藥劑量。取Bel7402細胞（葉酸受體高表達）分別給予主動靶向納米粒(FA-CS-LZ-NPs)、被動納米粒(CS-LZ-NPs)和川芎嗪溶液(LZ)，另取L-02(葉酸受體低表達)給予FA-CS-LZ-NPs，HPLC法檢測不同時間內細胞對LZ的攝取。FA-CS-LZ-N

3、Ps作用于三種葉酸受體表達水平不同的細胞，4h后，HPLC法檢測各組細胞內LZ的濃度。
　　3.主動靶向納米粒體內靶向性考察。異硫氰酸熒光素(FITC)標記FA-CS，紅外光譜、核磁共振光譜分析產物的結構表征。熒光素標記主動納米粒(FITC-FA-CS-NPs)和被動納米粒(FITC-CS-NPs)，H22荷瘤小鼠尾靜脈分別注射上述兩種標記藥物和FITC溶液后，于30min后活體熒光成像，隨即小鼠離體組織熒光成像。另取，H22荷瘤

4、小鼠分別尾靜脈給予FA-CS-LZ-NPs、CS-LZ-NPs和LZ，HPLC法分析在不同時間點小鼠血漿與組織內川芎嗪藥物濃度。
　　4.主動靶向納米粒抑制腫瘤轉移的研究。建立小鼠H22腫瘤轉移模型，隨機分為8組，分別給予:FA-CS-LZ-NPs(40mg/kg，高劑量)、(20mg/kg，中劑量)、(10mg/kg，低劑量)，CS-LZ-NPs(20mg/kg)，LZ(20mg/kg)，主動空納米粒(FA-CS-NPs)，5-

5、FU(20mg/kg)，生理鹽水(0.2mL)。連續(xù)給藥21天，比較各組小鼠體重變化，免疫組織化學檢測移植瘤中MMP-9、VEGF的蛋白表達水平，比較各組小鼠肺轉移結節(jié)數(shù)。
　　結果:
　　1.按照優(yōu)化處方(1mg/mL FA-CS，0.89mg/mL TPP, pH4.61)制備FA-CS-LZ-NPs，該納米粒的包封率為(36.72±0.65)％，載藥量為（9.44±0.17）％，粒徑為141.1±0.6 nm，分散度(

6、PDI)為0.219±0.011，Zeta電位為20.8±1.4 mv，可知實驗觀察值和模型預測值都比較接近，模型預測性良好。
　　2.Western Boltting測得Bel7402、L-02細胞葉酸表達水平具有顯著性差異，可用于后續(xù)試驗。主動靶向納米粒對Bel7402、L-02細胞的無毒劑量是LZ47.5μg·mL-1。Bel7402和L-02細胞給藥4h后，胞內川芎嗪濃度達到飽和，而且FA-CS-LZ-NPs組Bel740

7、2細胞內LZ藥物濃度顯著高于CS-LZ-NPs組、LZ溶液組以及L-02細胞FA-CS-LZ-NPs組。說明葉酸修飾的納米粒促進了Bel7402對藥物的攝取。Hela、Bel7402、L-02三種細胞分別給予FA-CS-LZ-NPs處理，經(jīng)HPLC檢測細胞內川芎嗪濃度由高到低依次為Hela＞ Bel7402＞L-02，證明細胞內藥物攝取量與細胞葉酸受體表達水平成正相關。
　　3.FITC-FA-CS與FA-CS相比，紅外圖譜中，在

8、1575cm-1處彎曲振動增強，是殼聚糖的氨基與FITC的異硫氰根反應的結果;核磁氫譜圖中，δ6.715，δ6.949 ppm處新增兩個位移值，為FITC芳烴質子峰，證明FITC偶聯(lián)到葉酸殼聚糖骨架上。活體成像觀察發(fā)現(xiàn)，與注射FITC-CS-NPs和FITC溶液相比，注射FITC-FA-CS-NPs荷瘤小鼠腫瘤部位的熒光強度要強。離體臟器成像和體內LZ藥物分布結果顯示，主動納米粒組在腫瘤組織的分布顯著高于被動納米粒組、溶液組。經(jīng)過葉酸修

9、飾的納米粒主要集中在腫瘤、肝、腎部位，而未經(jīng)葉酸修飾的納米粒主要集中在肝、肺部位，溶液組中組織分布較少。
　　4.5-FU組小鼠體重呈下降趨勢，其他給藥組均有不同程度增長，表明川芎嗪納米粒毒副作用小。MMP-9、VEGF蛋白表達水平呈劑量依賴性下調，且主動靶向納米粒抑制效果較好。FA-CS-LZ-NPs與CS-LZ-NPs、LZ溶液相比，抑制肺部轉移瘤效果更好，呈劑量依賴性。
　　結論:
　　本實驗優(yōu)化制備出的葉酸殼聚