川芎嗪抗腦缺血損傷及增強(qiáng)腦缺血耐受的作用和機(jī)制研究.pdf

1、目的：通過動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)川芎嗪(tetramethylpyrazine，TMP)具有抗腦缺血損傷以及增強(qiáng)CIP(腦預(yù)缺血，cerebralischemic preconditioning)腦保護(hù)效果、促進(jìn)腦缺血耐受形成的作用，并從調(diào)節(jié)腦組織NO含量、NOS活性和調(diào)控凋亡相關(guān)基因Bax、bcl-2蛋白表達(dá)等角度，初步探討其作用機(jī)制，進(jìn)一步為臨床使用TMP預(yù)防和治療腦缺血性疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法: 第一部分川芎嗪抗腦缺血損傷

2、及CIP腦保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究。將96只健康昆明小鼠隨機(jī)分為4組：假手術(shù)組、缺血損傷組、BFT模型組、TMP預(yù)防組。每組n=24。TMP預(yù)防組用川芎嗪按40mg/Kg/d腹腔注射，連續(xù)3d，假手術(shù)組、缺血損傷組、BIT模型組腹腔注射等量生理鹽水。第一次腹腔注射30min后所有小鼠經(jīng)10％水合氯醛0.33ml/100g腹腔麻醉，仰臥固定于手術(shù)臺上，頸前正中開口，鈍性分離雙側(cè)頸總動脈。BIT模型組用微動脈夾夾閉雙側(cè)頸總動脈6 min作為預(yù)處理

3、，然后恢復(fù)灌流。假手術(shù)組、缺血損傷組和TMP預(yù)防組只暴露雙側(cè)頸總動脈6 min，不阻斷血流。最后一次腹腔注射30min后，所有小鼠經(jīng)乙醚吸入麻醉，暴露雙側(cè)頸總動脈，缺血損傷組、BIT模型組、TMP預(yù)防組均阻斷血流20 min，然后恢復(fù)灌流，假手術(shù)組只暴露頸總動脈20min，不阻斷血流；術(shù)中及術(shù)后注意保暖，正常飲食。術(shù)后24h從各組隨機(jī)選取12只小鼠斷頭處死，迅速剝?nèi)∪X，左側(cè)半球低溫保存，采用生化方法檢測腦組織NOS活性和NO含量；右側(cè)

4、半球用4％多聚甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟切片，采用免疫組化方法檢測海馬組織Bax和bcl-2蛋白表達(dá)。其余小鼠于術(shù)后7d全部處死，迅速剝?nèi)∪X，冠狀切取視交叉后1至4mm腦片，多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟切片，HE染色，光鏡下觀察海馬CAl區(qū)組織學(xué)分級和神經(jīng)元密度(neuronaldensity，ND)。 第二部分川芎嗪增強(qiáng)腦缺血耐受的作用和機(jī)制研究。將96只健康昆明小鼠隨機(jī)分為4組：假手術(shù)組、缺血損傷組、BIT模型組、TMP干預(yù)組，每組

5、n=24。TMP干預(yù)組用川芎嗪按40mg/Kg/d腹腔注射，連續(xù)3d，假手術(shù)組、缺血損傷組腹腔注射等量生理鹽水。第一次腹腔注射30min后所有小鼠經(jīng)10％水合氯醛0.33ml/100g腹腔麻醉，仰臥固定于手術(shù)臺上，頸前正中開口，鈍性分離雙側(cè)頸總動脈。BIT模型組、TMP干預(yù)組用微動脈夾夾閉雙側(cè)頸總動脈6 min作為預(yù)處理，然后恢復(fù)灌流。假手術(shù)組、缺血損傷組只暴露雙側(cè)頸總動脈6 min，不阻斷血流。最后一次腹腔注射30min后，所有小鼠經(jīng)

6、乙醚吸入麻醉，暴露雙側(cè)頸總動脈，缺血損傷組、BIT模型組、TMP干預(yù)組均阻斷血流40 min，然后恢復(fù)灌流，假手術(shù)組只暴露頸總動脈40min，不阻斷血流；術(shù)中及術(shù)后注意保暖，正常飲食。術(shù)后24h從各組隨機(jī)選取12只小鼠斷頭處死，迅速剝?nèi)∪X，左側(cè)半球低溫保存，采用生化方法檢測腦組織NOS活性和NO含量；右側(cè)半球用4％。 多聚甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟切片，采用免疫組化方法檢測海馬組織Bax和bcl-2蛋白表達(dá)。其余小鼠于術(shù)后7d全部

7、處死，迅速剝?nèi)∪X，冠狀切取視交叉后1至4mm腦片，多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟切片，HE染色，光鏡下觀察海馬CA1區(qū)組織學(xué)分級和神經(jīng)元密度(neuronal density，ND)。 結(jié)果:第一部分川芎嗪抗腦缺血損傷及CIP腦保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究。 1. 術(shù)后7d海馬CA1區(qū)組織病理學(xué)改變光鏡觀察發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組海馬CA1區(qū)無明顯組織學(xué)損傷，組織學(xué)分級多為0級和1級。缺血損傷組海馬CA1區(qū)組織學(xué)損傷明顯，主要表現(xiàn)為錐體細(xì)胞缺失較

8、多，殘留的錐體細(xì)胞排列松散不規(guī)則，多數(shù)錐體細(xì)胞胞核固縮，組織學(xué)分級多為2級和3級，與假手術(shù)組相比有顯著性差異(P<0.01)。BIT模型組海馬CA1區(qū)組織學(xué)損傷輕微，組織學(xué)分級多為1級，與缺血損傷組相比差異顯著(P<0.01)。TMP預(yù)防組CA1區(qū)組織學(xué)損傷亦較輕微，組織學(xué)分級多為1級，與缺血損傷組相比差異顯著(P<0.05)。兩者比假手術(shù)組損傷嚴(yán)重，相比差異顯著(P<0.05)。 通過計(jì)算海馬CA1區(qū)神經(jīng)元密度得知，假手術(shù)組(

9、ND=214±17n/mm)和缺血損傷組(ND=74±9 n/mm)相比差異顯著(P<0.01)，BIT模型組(ND=158±18n/mm)和TMP預(yù)防組(ND=153±19n/mm)神經(jīng)元密度均明顯高于缺血損傷組(P<0.01)，而兩者又明顯低于假手術(shù)組(P<0.01)。 2. 術(shù)后24h腦組織NOS活性和NO含量變化缺血損傷組小鼠腦組織NOS活性(40.72±4.03U/gprot)與假手術(shù)組(17.01±4.96 U/gp

10、rot)相比明顯升高(P<0.01)，BIT模型組(31.56±2.48 U/gprot)和TMP預(yù)防組(31.08±2.38 U/gprot)NOS活性較缺血組明顯降低(P<0.01)，而較假手術(shù)組又明顯升高(P<0.01)。 NO含量缺血損傷組(1.42±0.11μmol/gprot)與假手術(shù)組(0.71±0.14μmol/gprot)相比明顯升高(P<0.01)，BIT模型組(1.08±0.10μmol/gprot)和TMP預(yù)防組

11、(1.03±0.09μmol/gprot)較缺血損傷組明顯降低(P<0.01)，而較假手術(shù)組又明顯升高(P<0.01)。 3. 術(shù)后24h海馬CA1區(qū)Bax和bcl-2蛋白表達(dá)變化假手術(shù)組Bax表達(dá)以±為主，bcl-2亦未見明顯表達(dá)。與假手術(shù)組相比，缺血損傷組Bax表達(dá)明顯增多，以++為主(P<0.01)，bcl-2表達(dá)亦見增多，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與缺血損傷組相比，BIT模型組、TMP預(yù)防組Bax表達(dá)明顯減少(P<

12、0.01)，以+為主，bcl-2表達(dá)明顯增多(P<0.01)。以++為主。兩者與假手術(shù)組比較Bax、bcl-2均有明顯差異(P<0.01)。 第二部分川芎嗪增強(qiáng)腦缺血耐受的作用和機(jī)制研究。 1. 術(shù)后7d海馬CA1區(qū)組織病理學(xué)改變假手術(shù)組海馬CA1區(qū)無明顯組織學(xué)損傷，組織學(xué)分級多為0級和1級，神經(jīng)元密度ND=214+17 n/mm；缺血損傷組海馬CA1區(qū)損傷明顯，組織學(xué)分級多為2級和3級，神經(jīng)元密度ND=58±14n/m

13、m，兩組相比有顯著性差異(P<0.01)。BIT模型組海馬CA1區(qū)損傷亦明顯，組織學(xué)分級多為2級和3級，神經(jīng)元密度ND=60±15n/mm，與缺血損傷組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TMP干預(yù)組海馬CA1區(qū)組織學(xué)分級多為1級和2級，明顯低于缺血損傷組和BIT模型組(P<0.01)，而神經(jīng)元密度(ND=111±13n/mm)明顯高于缺血損傷組和BIT模型組(P<0.01)。但和假手術(shù)組相比損傷依然明顯(P<0.01)。 2. 術(shù)后24h腦組織

14、NOS活性和NO含量變化缺血損傷組小鼠腦組織NOS活性(51.72±7.07U/gprot)、NO含量(1.78±0.21μmol/gprot)和BIT模型組NOS活性(50.45±6.18 U/gprot)、NO含量(1.69±0.12/μmol/gprot)與假手術(shù)組NOS活性(17.01±4.96 U/gprot)和NO含量(0.71±0.14μmol/gprot)相比明顯升高(P<0.01)，但兩者之間無差別。TMP干預(yù)組NOS

15、活性(34.74±4.18 U/gprot)、NO含量(1.33±0.11μmol/gprot)較缺血組、BIT模型組明顯降低(P<0.01)，而較假手術(shù)組又明顯升高(P<0.01)。 3. 術(shù)后24h海馬CAl區(qū)Bax和bcl-2蛋白表達(dá)變化與假手術(shù)組相比，缺血損傷組、BIT模型組Bax、bcl-2表達(dá)明顯增多(P<0.01)，而兩者之間無差異。TMP干預(yù)組較缺血損傷組、BIT模型組Bax表達(dá)明顯減弱(P<0.05)、bcl-

16、2表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0.05)。而較假手術(shù)組Bax、bcl-2表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0.01)。 結(jié)論: 1. 通過夾閉雙頸總動脈導(dǎo)致昆明小鼠前腦缺血20min，可引起明顯的海馬組織損傷，腦缺血40min可使海馬組織損傷有加重趨勢，而川芎嗪對腦缺血引起的小鼠海馬組織損傷具有明顯的保護(hù)作用。 2. 川芎嗪能夠明顯降低缺血腦組織NO含量和NOS活性，從而抑制其神經(jīng)毒性作用，減輕腦損傷；同時，川芎嗪能夠明顯增強(qiáng)海馬CA1區(qū)

17、bcl-2蛋白表達(dá)，降低Bax蛋白表達(dá)，上調(diào)bcl-2/Bax比例，從而抑制細(xì)胞凋亡，減輕腦缺血引起的海馬神經(jīng)元損傷。這可能是本方抗腦缺血損傷的重要機(jī)制之一。 3. 以6min腦缺血作為預(yù)處理(CIP)，可對間隔2d后20min腦缺血引起的海馬神經(jīng)元損傷產(chǎn)生一定的保護(hù)作用。但是，6min CIP的腦保護(hù)作用是有限的，對后續(xù)40min腦缺血引起的海馬神經(jīng)元損傷幾乎不產(chǎn)生保護(hù)，而川芎嗪能夠?qū)IP產(chǎn)生良性干預(yù)效應(yīng)，增強(qiáng)其腦保護(hù)作用，