川芎嗪芪類衍生物DLJ14和阿霉素合用抑制MCF-7-A細胞體內(nèi)外增殖作用的機制研究.pdf

1、川芎嗪(tetra methyl pyrazine，TMP)是傘形科蒿本屬植物川芎Ligusticumchuanxiong Hort根莖中分離提純的一種生物堿為中藥川芎的有效活性成分之一。目前已有很多文獻報道TMP具有逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥的活性，但由于甲基易被氧化而導(dǎo)致其半衰期短、生物利用度低，限制其臨床應(yīng)用。為了克服其缺點，我們合成了一系列川芎嗪芪類衍生物并篩選出具有較好活性的DLJ14((E)-2-(2，4，-二甲氧基苯乙烯基)-3，5

2、，6-三甲基吡嗪）。前期實驗結(jié)果已經(jīng)證實:DLJ14能逆轉(zhuǎn)人慢性粒細胞性白血病耐阿霉素細胞株K562/A02和人乳腺癌耐阿霉素細胞株MCF-7/A對阿霉素的耐藥性。但是，DLJ14和阿霉素合用后提高阿霉素抗腫瘤作用的機制并沒有完全闡明。本課題將進一步探討川芎嗪芪類衍生物DLJ14和阿霉素合用對人乳腺癌耐阿霉素細胞MCF-7/A體內(nèi)外增殖的抑制作用及作用機制。
　　首先，體外MTT實驗表明:DLJ14和阿霉素合用能明顯增強對MCF-

3、7/A細胞的抑制作用，與阿霉素單用組比較有顯著性差異。體內(nèi)裸鼠荷瘤實驗表明:與陰性對照組相比，DLJ14單用(4mg/kg，8mg/kg)和阿霉素(1mg/kg)單用對阿霉素耐藥移植瘤的增殖抑制作用弱;而DLJ14(4mg/kg，8mg/kg)和阿霉素(1mg/kg)聯(lián)合用藥對阿霉素耐藥移植瘤的生長有顯著抑制作用，與阿霉素單用組相比具有顯著的統(tǒng)計學意義。細胞周期實驗顯示DLJ14和阿霉素合用能將MCF-7/A細胞阻滯在G2/M期，該阻滯

4、作用與升高P53蛋白和P21蛋白表達，降低CyclinA蛋白表達有關(guān)。Hoechst33258染色實驗和AnnexinⅤ-FITC/Propidiumiodide(PI)雙染實驗結(jié)果表明:與單用阿霉素比較，DLJ14和阿霉素合用能顯著誘導(dǎo)MCF-7/A細胞凋亡，呈現(xiàn)明顯的染色質(zhì)濃縮、聚集在核周邊或核膜破裂的現(xiàn)象，晚期凋亡細胞數(shù)顯著增多。Westernblotting檢測凋亡相關(guān)蛋白表達，結(jié)果顯示:Bax/Bcl-2比率、cleavedc

5、aspase-9和cleavedcaspase-3蛋白量均明顯增多。JC-1檢測細胞線粒體膜電位和Westernblotting分別檢測線粒體和胞漿中cytochromec蛋白量，結(jié)果顯示:與單用阿霉素比較，DLJ14和阿霉素合用組去極化線粒體的細胞比例增多，即細胞線粒體膜電勢降低，cytochromec從線粒體釋放到胞漿，表明MCF-7/A細胞發(fā)生凋亡可能通過線粒體通路。進一步對細胞生長相關(guān)信號通路進行分析，結(jié)果顯示DLJ14和阿霉素

6、合用可抑制細胞EGFR和PI3K蛋白的表達及細胞存活信號EGFR和Akt的磷酸化，而對非磷酸化Akt蛋白的表達量無影響。上述結(jié)果表明DLJ14和阿霉素合用后可通過抑制EGFR/PI3K/Akt細胞存活信號通路來誘導(dǎo)線粒體介導(dǎo)的細胞凋亡，加強阿霉素的細胞毒作用。
　　其次，探討了DLJ14對ABC超家族耐藥相關(guān)蛋白P-gp和BCRP的影響。P-gp底物羅丹明123細胞內(nèi)蓄積實驗表明:與單用阿霉素比較，DLJ14和阿霉素合用組中羅丹明

7、123的熒光強度明顯增強，即羅丹明123外排減少，細胞內(nèi)蓄積增多。細胞內(nèi)ATP含量測定和細胞中Ca2+-Mg2+ATPase活性檢測表明:與單用阿霉素比較，DLJ14和阿霉素合用組中ATP含量和Ca2+-Mg2+ATPase活性均顯著降低。Westernblotting進一步分析顯示:與單用阿霉素比較，DLJ14和阿霉素合用后能明顯降低細胞中ERK、P-ERK、P-gp和BCRP蛋白的表達。上述結(jié)果表明DLJ14和阿霉素合用能通過抑制A