川芎嗪對人肝癌多藥耐藥細胞ABC家族的抑制作用.pdf

1、本研究分為二部分：
　　 第一部分：人肝癌多藥耐藥細胞系BEL-7402/ADM的建立
　　 一、人肝癌多藥耐藥細胞株BEL-7402/ADM的建立
　　 以文獻方法采用體外低濃度梯度遞增聯(lián)合大劑量間斷沖擊誘導的模式，建立人肝癌BEL-7402/ADM 耐藥細胞株。
　　 二、MTT法測定人肝癌多藥耐藥細胞系BEL-7402/ADM的耐藥倍數(shù)
　　 取親本細胞及耐藥細胞，用0.25%胰酶消化處理對

2、數(shù)生長期細胞，用含8%FCS的RPMI 1640培養(yǎng)液配成細胞懸液，每孔接種200μL，即2×104個∕mL，接種在96孔板上，設有空白對照組、陰性對照組、ADM組、5-FU組、VCR組和CDDP組，以上給藥組均設5個濃度。在酶聯(lián)免疫檢測儀上選定490nm波長處測定OD值，參比波長為620nm。按下列公式計算細胞生長抑制率：生長抑制率=（1－給藥組平均OD值/對照組平均OD值）×100%.公式計算IC50值：lgIC50=Xm-I[P-

3、(3-Pm-Pn)/4]，Xm：lg 最大劑量；I：lg(最大劑量/相鄰劑量)；P：陽性反應率之和；Pm：最大陽性反應率；Pn：最小陽性反應率。耐藥倍數(shù) (RI)=(IC Resistance group)/(IC Parental group)×100%.
　　 三、ADM不同誘導濃度對人肝癌細胞系BEL-7402中P-gp表達的影響
　　 以Western-blot法檢測在200、600﹑800﹑1000﹑2000

4、nmol/L不同ADM濃度誘導至穩(wěn)定增殖的肝癌BEL-7402細胞的P-gp的表達。結果以各組P-gp/α-tublin與未誘導的親本細胞（control組）的比值百分率（均值±標準差，X±SD）表示。
　　 四、細胞周期分析
　　 取對數(shù)生長期的BEL-7402、BEL-7402/ADM細胞于流式細胞儀測定DNA含量并進行細胞周期分析。
　　 五、流式細胞儀檢測親本細胞及耐藥細胞內(nèi)阿霉素的蓄積
　　 將

5、對數(shù)生長期的BEL-7402、BEL-7402/ADM細胞以8000 nmol/L ADM培養(yǎng)2h后，流式細胞儀檢測細胞內(nèi)ADM平均熒光強度。
　　 六、細胞貼壁率與平板克隆形成率的檢測
　　 收集BEL-7402親本細胞及BEL-7402/ADM多藥耐藥細胞，制備成單細胞懸液。以載玻片進行臺盼藍染色活細胞計數(shù)，各按每瓶1×106個分別接種于6個培養(yǎng)瓶內(nèi)。每間隔1h取1組細胞，吸棄未貼壁的細胞，消化貼壁細胞，進行細胞計數(shù)

6、。根據(jù)以下公式計算細胞貼壁率:細胞貼壁率=(貼壁細胞數(shù)/接種細胞數(shù))×100%。細胞平板克隆形成率參考文獻實驗方法。
　　 結論：
　　 1.本研究采用體外低濃度梯度遞增聯(lián)合大劑量間斷沖擊誘導的模式，成功建立了人肝癌BEL-7402/ADM 耐藥細胞株，實驗結果表明，該細胞株雖然為ADM所誘導耐藥，但該耐藥株不僅對ADM產(chǎn)生了較高的耐藥性，對5－FU、VCR 及CDDP 亦有不同程度的耐藥性，證實了其類型為多藥耐藥。耐藥

7、細胞株經(jīng)凍存后復蘇并連續(xù)脫藥培養(yǎng)1個月后，其耐藥性可有所有下降，但通過短暫的藥物再次誘導，耐藥性仍能恢復至凍存之前的水平，與文獻報道一致。
　　 2.從Western blot結果看，當阿霉素誘導濃度在200 nmol/L時，對BEL－7402細胞P-gp的表達無影響。當濃度在600 nmol/L以上時，P-gp表達顯著升高，但P-gp的表達量并不隨誘導劑量增加而顯著增加，而是耐藥表型隨著藥物的增加而逐漸穩(wěn)定。由于腫瘤多藥耐藥機

8、制非常復雜，可能存在多機制聯(lián)合作用導致耐藥，有待下一步實驗證實。
　　 3.有關腫瘤耐藥細胞周期與其親本細胞的區(qū)別，文獻報道不一。本研究中細胞周期實驗結果顯示，耐藥細胞與親本細胞存在一定差異。表現(xiàn)在耐藥細胞G0/G1比值減小，而G2/M、S期增加。各實驗室結果差異除了可能與實驗條件不盡相同、誘導方法、操作誤差等都有關系。此外，耐藥的肝癌細胞在貼壁率、平板克隆形成率、細胞形態(tài)上與親本細胞還存在差異。
　　 4.流式細胞儀檢

9、測結果，說明阿霉素誘導的多藥耐藥細胞耐藥的機制與外排藥物有關。結合Western blot結果，考慮可能P-gp參與了這一機制。
　　 第二部分：川芎嗪逆轉(zhuǎn)人肝癌多藥耐藥細胞BEL-7402/ADM的作用及機制
　　 一、MTT法測定川芎嗪對人肝癌多藥耐藥細胞BEL-7402/ADM的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)
　　 將BEL-7402/ADM 以 TMP (400和 600 μmol/L)、VRP (5和 10μmol/L)分別

10、培養(yǎng)于96孔板至24 h，然后分別加入濃度為0.3，0.6，1.2，2.4，4.8 μmol/L的ADM 至 72 h。其中維拉帕米（Verapamil，VRP）為陽性對照。分別計算IC50 值、耐藥倍數(shù)、逆轉(zhuǎn)倍數(shù)。其中IC50值的計算按第一部分“MTT法測定人肝癌多藥耐藥細胞系BEL-7402/ADM的耐藥倍數(shù)”計算。逆轉(zhuǎn)倍數(shù)=(IC50 Resistance group)/(IC50 TMP/VRP group)×100%.

11、　　 二、熒光顯微鏡觀察川芎嗪對人肝癌多藥耐藥細胞BEL-7402/ADM中ADM蓄積的影響
　　 將生長良好的BEL-7402/ADM及其親本細胞于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜，分為6組,陰性親本組、陰性耐藥組、親本組、耐藥組、TMP逆轉(zhuǎn)組、陽性對照組（VRP）。接種于培養(yǎng)瓶中，逆轉(zhuǎn)組加入川芎嗪至終濃度為600μmol/L，陽性對照組（VRP），加入VRP至終濃度為5μmol/L，逆轉(zhuǎn)組及陽性對照組在TMP或VRP中預培養(yǎng)3h，再與親本

12、組、耐藥組平行加入8000 nmol/L ADM培養(yǎng)2h，陰性親本組、陰性耐藥組加入新鮮培養(yǎng)液，不加任何藥物；各組以冰冷的PBS洗3次，熒光顯微鏡下直接觀察細胞內(nèi)阿霉素的含量。激發(fā)光(λex)為480nm，發(fā)射光(λem)為575 nm。
　　 三、流式細胞儀檢測川芎嗪對人肝癌多藥耐藥細胞BEL-7402/ADM中ADM蓄積的影響
　　 設陰性組、耐藥組、TMP組、VRP組。接種于培養(yǎng)瓶中，陰性對照組加入新鮮培養(yǎng)液，逆轉(zhuǎn)

13、組加入川芎嗪至終濃度為600μmol/L，陽性對照組（VRP），加入VRP至終濃度為5μmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)24h，加入ADM8000nmol/L，培養(yǎng)2h，以冰冷的PBS洗3次，胰酶消化為單個細胞懸液（不低于106個/mL）,流式細胞儀檢測細胞內(nèi)ADM平均熒光強度。激發(fā)光(λex)為480nm，發(fā)射光 (λem)為575nm.
　　 四、HPLC法檢測TMP對細胞內(nèi)ADM濃度的影響
　　 設親本組、耐藥組、TMP組、V

14、RP組。將TMP組、VRP組分別在TMP（600μmol/L）或VRP（5μmol/L中預培養(yǎng)3h，所有組再以8000 nmol/L ADM 培養(yǎng)2h，以HPLC檢測細胞內(nèi)ADM濃度。以目標藥與內(nèi)標的峰面積的比值為橫坐標，以藥物的濃度為縱坐標，做標準曲線，并考察重現(xiàn)性、精密度、加樣回收率、穩(wěn)定性等。實驗結果以鹽酸阿霉素（分子量579.99）濃度單位折算為nmol/L。
　　 五、川芎嗪對人肝癌多藥耐藥細胞BEL-7402/ADM

15、中MDR1、MRP2、MRP3、MRP5 mRNA表達的影響
　　 設耐藥組、TMP組、VRP組。將TMP組、VRP組分別在TMP（600μmol/L）或VRP（5μmol/L）中預培養(yǎng)3h，所有組再以8000 nmol/L ADM培養(yǎng)2h，采用PCR檢測MDR1，MRP2，MRP3和MRP5 mRNA表達水平。
　　 六、川芎嗪對人肝癌多藥耐藥細胞BEL-7402/ADM中P-gp、MRP2、MRP3、MRP5蛋白表達

16、的影響
　　 細胞分設耐藥組、TMP組、VRP組。將TMP組、VRP組分別在TMP（600μmol/L）或VRP（5μmol/L）中預培養(yǎng)3h，所有組再以8000 nmol/L ADM培養(yǎng)2h，采用免疫印跡檢測P-gp、MRP2、MRP3、MRP5蛋白表達水平。
　　 結論：
　　 1.川芎嗪（Tetramethylpyrazine，TMP)自中藥川芎中分離，有研究表明其對 HCC的耐藥有作用，可能與逆轉(zhuǎn)P－gp

17、有關，但仍然未見是否與逆轉(zhuǎn)其它蛋白有關。本研究探討了TMP對人肝癌多藥耐藥細胞BEL-7402/ADM MDR的逆轉(zhuǎn)作用。研究發(fā)現(xiàn)：TMP可逆轉(zhuǎn)肝癌多藥耐藥細胞BEL-7402/ADM的MDR。
　　 2.TMP作用后，耐藥細胞內(nèi)的ADM蓄積增加，推測可能是由于TMP影響了ABC家族成員的一種或數(shù)種蛋白的表達及功能所致。
　　 3.Realtime PCR 及 Western blot結果證實，TMP作用于多藥耐藥細胞后

18、MDR1、MRP2、MRP3及MRP5在肝癌耐藥株細胞中mRNA及蛋白高表達可能發(fā)揮聯(lián)合耐藥作用，并可被TMP所抑制。
　　 4.研究還發(fā)現(xiàn)：TMP和第一代逆轉(zhuǎn)劑VRP均可以抑制MDR1，但川芎嗪對MRP2，MRP3，MRP5亦有效，不同于VRP；研究還發(fā)現(xiàn)：TMP和第一代逆轉(zhuǎn)劑VRP均可以抑制MDR1，但川芎嗪對MRP2，MRP3，MRP5亦有效，不同于VRP；TMP在使細胞內(nèi)阿霉素濃度蓄積增加的同時，川芎嗪本身在細胞內(nèi)的蓄積