COX-2介導(dǎo)川芎嗪抑制肺癌A549細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的作用研究.pdf

1、1.背景：
　　 肺癌患者的死亡率處于各種惡性腫瘤的首位，侵襲和轉(zhuǎn)移是肺癌治療失敗的重要原因之一。腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是一個(gè)多環(huán)節(jié)、多步驟的復(fù)雜過(guò)程，涉及的細(xì)胞因子及分子機(jī)制為腫瘤的防治提供了靶點(diǎn)。環(huán)氧化酶(cyclooxygenase，COX)就是其中非常重要一條途徑。
　　 COX是分解花生四烯酸(arachidonic acid，AA)生成各種內(nèi)源性前列腺素（Prostaglandins，PGs）過(guò)程中關(guān)鍵的限速酶。1

2、991年研究證實(shí)有兩種COX存在，即結(jié)構(gòu)型COX-1和誘生型COX-2。COX-1被認(rèn)為是“看家”基因，幾乎在所有正常組織中結(jié)構(gòu)性表達(dá)，介導(dǎo)維持生理性自身穩(wěn)定的前列腺素合成，因而具有保護(hù)胃表面上皮細(xì)胞，擴(kuò)張腎血管等功能。COX-2為可誘生型COX，正常生理狀態(tài)下多數(shù)組織內(nèi)檢測(cè)不到。當(dāng)細(xì)胞受到炎癥信號(hào)、某些細(xì)胞因子等刺激后表達(dá)增加。研究證實(shí)，COX-2的表達(dá)在包括肺癌在內(nèi)的多種腫瘤中明顯增高，COX-2表達(dá)陽(yáng)性組腫瘤有更強(qiáng)的侵襲性，患者生

3、存期縮短，提示COX-2與腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲轉(zhuǎn)移及患者不良預(yù)后密切相關(guān)。COX-2表達(dá)強(qiáng)度以非小細(xì)胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer,NSCLC)中的腺癌最高，呈中強(qiáng)而廣泛的表達(dá)，其次為鱗癌，小細(xì)胞肺癌中只有很少個(gè)別病例能檢測(cè)到中等水平的表達(dá)。COX-2在正常支氣管上皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞未見表達(dá)或弱表達(dá)。COX-2可通過(guò)多種致癌機(jī)制參與NSCLC的發(fā)生發(fā)展，有研究提出，雖然腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是一個(gè)多步驟的復(fù)雜過(guò)程，

4、但COX-2，很可能是這一過(guò)程的一個(gè)中心調(diào)控因素。
　　 目前對(duì)COX-2有抑制作用的藥物主要是非甾體類抗炎藥(non-steroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs)，包括COX非選擇性抑制劑和COX-2選擇性抑制劑。COX非選擇性抑制劑因同時(shí)抑制了COX-1而存在不容忽視的消化道副作用如消化道潰瘍甚至出血;COX-2選擇性抑制劑的胃腸道副作用減輕，但COX-2選擇性抑制劑的腎毒性和引起心血管

5、不良事件發(fā)生率增高的副作用同樣不容忽視，使COX-2選擇性抑制劑在腫瘤防治中長(zhǎng)期應(yīng)用的安全性受到質(zhì)疑。更為安全有效的COX-2抑制劑有待進(jìn)一步研究和發(fā)現(xiàn)。
　　 川芎嗪(tetramethylpyrazine，TMP)，是從中藥川芎中分離提純出來(lái)的一種生物堿，其化學(xué)結(jié)構(gòu)明確，為四甲基吡嗪，我們熟知的藥理作用包括阻滯平滑肌的鈣通道、抑制血小板聚集及激活等，目前臨床主要應(yīng)用于缺血性心、腦血管疾病的治療。在中國(guó)，中醫(yī)活血化淤法及其方藥

6、治療腫瘤有悠久的歷史和確切的療效，而川芎嗪作為活血化淤類中藥川芎的提取物，關(guān)于其在腫瘤防治中的研究報(bào)導(dǎo)，自上個(gè)世紀(jì)八十年代以來(lái)陸續(xù)出現(xiàn)并日益受到人們的關(guān)注。我們課題組前期研究發(fā)現(xiàn)川芎嗪可調(diào)節(jié)肺癌患者的Th1/Th2平衡而發(fā)揮抗腫瘤的免疫治療作用。研究顯示川芎嗪還可通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，改善荷瘤機(jī)體的高凝狀態(tài)等方面，抑制肺癌的生長(zhǎng)和侵襲轉(zhuǎn)移，在腫瘤的預(yù)防和治療中，顯示出重要的應(yīng)用價(jià)值和良好的應(yīng)用前景。但也有研究報(bào)導(dǎo)，川芎嗪可在不同程度上

7、增加肺癌細(xì)胞的粘附。而且，目前關(guān)于川芎嗪在肺癌防治中的作用，主要局限于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)或細(xì)胞行為的觀察，對(duì)于其作用的細(xì)胞分子機(jī)制知之甚少，對(duì)于細(xì)胞因子、基因調(diào)控和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等方面的研究，還有待進(jìn)一步深入。
　　 2004年，萬(wàn)敬員等研究發(fā)現(xiàn)川芎嗪可顯著減少脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激的小鼠心肌巨噬細(xì)胞COX-2mRNA和蛋白表達(dá)，從而拮抗LPS誘導(dǎo)的乳鼠心肌細(xì)胞凋亡，但對(duì)COX-2活性無(wú)明顯作用。2008

8、年，張凌等研究發(fā)現(xiàn)川芎嗪可明顯減少急性肺血栓栓塞癥大鼠COX-2的表達(dá)，從而減輕炎癥反應(yīng)。但是自發(fā)現(xiàn)COX-2以來(lái)，關(guān)于川芎嗪對(duì)肺癌中COX-2的作用及其意義尚未有報(bào)導(dǎo)。鑒于此，我們?cè)O(shè)想以COX-2為切入點(diǎn)，對(duì)川芎嗪在肺癌特別是肺癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及其細(xì)胞分子機(jī)制進(jìn)行探討。根據(jù)COX-2在肺癌中的表達(dá)特性，我們選用了COX-2表達(dá)較高的人肺腺癌A549細(xì)胞進(jìn)行研究。選取COX非特異性抑制劑吲哚美辛(indomethacin，IN)為陽(yáng)性

9、對(duì)照藥物。
　　 因?yàn)槟壳瓣P(guān)于川芎嗪對(duì)A549細(xì)胞作用的相關(guān)研究甚少，因此我們首先觀察了不同濃度川芎嗪對(duì)A549細(xì)胞增殖活性的影響，并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行了初步探討，主要目的在于篩選下一步實(shí)驗(yàn)所選用的川芎嗪實(shí)驗(yàn)濃度和觀察時(shí)間點(diǎn)。第二部分，我們利用Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)以及建立腫瘤肺轉(zhuǎn)移的動(dòng)物模型，通過(guò)體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察川芎嗪對(duì)A549細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響。第三部分，我們分別從酶活性、蛋白表達(dá)、催化產(chǎn)物和組織水平檢測(cè)了上述過(guò)程

10、中川芎嗪對(duì)A549細(xì)胞COX-2的影響，對(duì)COX-2在川芎嗪抑制肺癌A549細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移中的作用進(jìn)行探討。
　　 2.研究?jī)?nèi)容
　　 第一部分川芎嗪對(duì)人肺癌A549細(xì)胞增殖的作用及機(jī)制研究
　　 目的：
　　 (1)觀察川芎嗪對(duì)A549細(xì)胞增殖活性的影響，并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行初步探討;
　　 (2)篩選下一步實(shí)驗(yàn)選用的川芎嗪濃度和作用時(shí)間點(diǎn)。
　　 方法：
　　 研究選用藥物為鹽酸川芎嗪

11、注射液，(北京市永康藥業(yè)有限公司，40mg/2ml)。鹽酸川芎嗪注射液是目前臨床和實(shí)驗(yàn)室研究川芎嗪常用的藥物劑型，也便于保證細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)所用研究藥物的一致性。
　　 (1)MTT方法檢測(cè)川芎嗪對(duì)A549細(xì)胞增殖活性的作用:100～1000μg/ml共十個(gè)川芎嗪濃度組，分別與A549細(xì)胞培養(yǎng)24，48和72小時(shí)，MTT方法檢測(cè)各組細(xì)胞相對(duì)存活率。
　　 (2)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)川芎嗪對(duì)A549細(xì)胞的細(xì)胞周期影響:A549

12、細(xì)胞與200μg/ml川芎嗪（TMP200組），400μg/ml川芎嗪（TMP400組），800μg/ml川芎嗪（TMP800組），以及陽(yáng)性對(duì)照200μM吲哚美辛（IN組）分別培養(yǎng)24、48和72小時(shí)，收集細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞周期的百分比。
　　 (3)Wersternblot方法檢測(cè)川芎嗪對(duì)A549細(xì)胞中ERK1/2蛋白表達(dá)的影響:A549細(xì)胞與200μg/ml川芎嗪（TMP200組），400μg/ml川芎嗪(TMP4

13、00組)，800μg/ml川芎嗪（TMP800組），以及陽(yáng)性對(duì)照200μM吲哚美辛（IN組）分別培養(yǎng)24、48和72小時(shí)，收集細(xì)胞提取蛋白，Wersternblot方法檢測(cè)各組p-ERK1/2和總ERK1/2蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 (1)川芎嗪可抑制A549細(xì)胞的增殖活性，其作用呈時(shí)間和劑量依賴性。根據(jù)結(jié)果，選取200，400和800μg/ml川芎嗪進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn);選取對(duì)A549細(xì)胞增殖活性沒有明顯影響的20

14、0μg/ml川芎嗪進(jìn)行細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)。
　　 (2)川芎嗪培養(yǎng)組G0-G1期的細(xì)胞比率較對(duì)照組明顯增多，使相應(yīng)S期細(xì)胞比率減少。川芎嗪對(duì)A549細(xì)胞周期的阻滯作用呈劑量依賴性。
　　 (3)川芎嗪可抑制A549細(xì)胞中p-ERK1/2的蛋白表達(dá)，其作用呈時(shí)間和劑量依賴性。
　　 結(jié)論：
　　 (1)川芎嗪可抑制A549細(xì)胞的增殖，其作用呈時(shí)間和劑量依賴性。
　　 (2)川芎嗪可通過(guò)阻滯A549細(xì)胞于細(xì)

15、胞周期的G0-G1期而抑制其增殖。
　　 (3)ERK是川芎嗪抑制A549細(xì)胞增殖的機(jī)制之一。
　　 第二部分:川芎嗪對(duì)人肺癌A549細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的作用研究
　　 目的:
　　 (1)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)觀察川芎嗪對(duì)A549細(xì)胞侵襲力的影響;
　　 (2)體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察川芎嗪對(duì)A549細(xì)胞遠(yuǎn)處肺轉(zhuǎn)移的影響。
　　 方法:
　　 (1)Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)川芎嗪對(duì)A549細(xì)胞侵襲

16、能力的影響:在底部鋪有Matrigel的Transwell小室中，A549細(xì)胞和200μg/ml川芎嗪組培養(yǎng)24小時(shí)，穿越至Transwell小室底部的細(xì)胞固定、染色、計(jì)數(shù)，和對(duì)照組比較統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)的變化。
　　 (2)ELISA方法檢測(cè)川芎嗪對(duì)A549細(xì)胞MMP-2/TIMP-2分泌水平的影響:A549細(xì)胞分別和200μg/ml川芎嗪(TMP200)，400μg/ml川芎嗪（TMP400），800μg/ml川芎嗪(TMP800)

17、，陽(yáng)性對(duì)照200μM吲哚美辛（IN）以及空白對(duì)照培養(yǎng)液分別培養(yǎng)24小時(shí)，收集各組的培養(yǎng)上清液，ELISA方法檢測(cè)各組MMP-2/TIMP-2的濃度。
　　 (3)利用BALB/c裸鼠，通過(guò)尾靜脈注射法建立A549細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移的動(dòng)物模型。觀察A549細(xì)胞在肺內(nèi)轉(zhuǎn)移過(guò)程，確定實(shí)驗(yàn)觀察時(shí)間點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)組給予腹腔注射川芎嗪100mg/kg/day，對(duì)照組給予等劑量生理鹽水，每天觀察裸鼠的毛發(fā)、飲食和精神狀態(tài)，每4天稱重，28天后殺死裸鼠取肺，

18、計(jì)數(shù)裸鼠肺表面轉(zhuǎn)移瘤的數(shù)目;H&E染色，組織學(xué)檢測(cè)肺內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤的情況。
　　 結(jié)果:
　　 (1)川芎嗪對(duì)A549細(xì)胞侵襲力的影響:A549細(xì)胞與200μg/ml川芎嗪共培養(yǎng)24小時(shí)后，穿越過(guò)Transwell小室基底膜的細(xì)胞數(shù)與對(duì)照組相比明顯減少，表明川芎嗪對(duì)A549細(xì)胞的侵襲力具有明顯的抑制作用。
　　 (2)川芎嗪對(duì)A549細(xì)胞分泌MMP-2/TIMP-2的作用:培養(yǎng)24小時(shí)后，TMP200，TMP400和T

19、MP800組MMP-2/TIMP-2的水平較對(duì)照組均有顯著意義的降低，表明川芎嗪對(duì)A549細(xì)胞分泌MMP-2/TIMP-2具有抑制作用。抑制作用隨川芎嗪劑量的增加而增強(qiáng)。
　　 (3)川芎嗪對(duì)A549細(xì)胞遠(yuǎn)處肺轉(zhuǎn)移的作用:通過(guò)尾靜脈注射法可成功建立裸鼠肺轉(zhuǎn)移的動(dòng)物模型。通過(guò)觀察A549細(xì)胞在肺內(nèi)轉(zhuǎn)移過(guò)程，選用經(jīng)尾靜脈注射A549細(xì)胞后第29天作為獲取裸鼠肺組織的時(shí)間點(diǎn)。川芎嗪治療組A549細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移瘤的數(shù)目和大小較對(duì)照組均明顯減

20、少。除了可很快緩解的局部刺激癥狀，川芎嗪治療組裸鼠的精神狀態(tài)和體重較對(duì)照組無(wú)明顯差別。
　　 結(jié)論:
　　 (1)川芎嗪對(duì)人肺癌A549細(xì)胞的侵襲力具有明顯的抑制作用。
　　 (2)川芎嗪能夠抑制A549細(xì)胞的體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移，并表現(xiàn)出較低的毒副作用和較好的安全性。
　　 (3)首次提示MMP-2/TIMP-2可能是川芎嗪抑制A549細(xì)胞侵襲的作用機(jī)制之一。
　　 第三部分:川芎嗪對(duì)人肺癌A549細(xì)胞C

21、OX-2的作用研究
　　 目的:
　　 分別從酶活性、蛋白表達(dá)、代謝產(chǎn)物和組織水平，觀察川芎嗪抑制肺癌A549細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中COX-2的變化，探討COX-2在川芎嗪抑制肺癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用。
　　 方法:
　　 (1)COX-2酶活性的檢測(cè):A549細(xì)胞分別和200μg/ml川芎嗪(TMP200)，400μg/ml川芎嗪(TMP400)，800μg/ml川芎嗪(TMP800)，陽(yáng)性對(duì)照200μM吲哚美

22、辛(IN)以及空白對(duì)照培養(yǎng)液分別培養(yǎng)24小時(shí)，收集細(xì)胞，超聲破碎細(xì)胞，提取上清液，采用COX酶活性熒光檢測(cè)試劑盒測(cè)定各組酶活性。
　　 (2)Westernblot方法檢測(cè)A549細(xì)胞中COX-2的蛋白表達(dá):上述各組細(xì)胞分別培養(yǎng)24小時(shí)，收集細(xì)胞，提取蛋白，采用Westernblot方法檢測(cè)各組A549細(xì)胞中COX-2的蛋白表達(dá)。
　　 (3)放射性免疫測(cè)定A549細(xì)胞培養(yǎng)上清液中PGE2的濃度:上述各組細(xì)胞分別培養(yǎng)24

23、小時(shí)，收集上清液，放射性免疫法測(cè)定各組PGE2的濃度。
　　 (4)免疫組化方法檢測(cè)A549細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移瘤組織中COX-2的表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 (1)川芎嗪對(duì)A549細(xì)胞COX-2酶活性的影響:A549細(xì)胞經(jīng)川芎嗪培養(yǎng)24小時(shí)后，與吲哚美辛組一樣，TMP200，TMP400和TMP800組COX-2的酶活性較對(duì)照組均明顯下降，但各川芎嗪組間未表現(xiàn)出明顯差異。
　　 (2)川芎嗪對(duì)A549細(xì)胞中COX

24、-2蛋白表達(dá)的影響:培養(yǎng)24小時(shí)后，IN組COX-2的蛋白表達(dá)較對(duì)照組減弱;而各川芎嗪培養(yǎng)組COX-2的蛋白表達(dá)和對(duì)照組相比無(wú)明顯差別，提示川芎嗪對(duì)A549細(xì)胞中COX-2的蛋白表達(dá)無(wú)明顯影響。
　　 (3)川芎嗪對(duì)A549細(xì)胞分泌PGE2的影響:A549細(xì)胞與200μM吲哚美辛(IN)培養(yǎng)24小時(shí)后，細(xì)胞上清液中PGE2的濃度較對(duì)照組明顯降低。與IN組相似，各川芎嗪培養(yǎng)組PGE2的濃度較對(duì)照組均明顯降低，差異具有顯著性(p＜0

25、.05)。TMP200、TMP400和TMP800各組間未表現(xiàn)出明顯差別。
　　 (4)川芎嗪對(duì)A549細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移瘤組織中COX-2表達(dá)的影響:川芎嗪治療組裸鼠肺轉(zhuǎn)移瘤COX-2染色陽(yáng)性細(xì)胞和顆粒顏色均較對(duì)照組明顯降低。
　　 結(jié)論:
　　 (1)川芎嗪可抑制A549細(xì)胞中COX-2的酶活性和肺轉(zhuǎn)移瘤組織中COX-2的表達(dá)，對(duì)A549細(xì)胞中COX-2的蛋白表達(dá)無(wú)明顯影響。
　　 (2)COX-2是川芎嗪抑

26、制肺癌侵襲轉(zhuǎn)移的重要作用靶點(diǎn)之一。
　　 3.研究的限制性
　　 本研究初步只觀察了川芎嗪對(duì)肺癌A549這一個(gè)細(xì)胞系的作用，關(guān)于COX-2介導(dǎo)的川芎嗪抑制NSCLC侵襲轉(zhuǎn)移的作用，還需進(jìn)一步利用更多的NSCLC細(xì)胞系進(jìn)行觀察，以使結(jié)果更為翔實(shí)。
　　 4.研究創(chuàng)新點(diǎn)
　　 (1)通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察了川芎嗪對(duì)肺癌A549細(xì)胞的作用，結(jié)果顯示川芎嗪能夠抑制A549細(xì)胞的增殖，并在更低的濃度和更早的時(shí)間

27、顯示出更為突出的抗腫瘤侵襲作用。
　　 (2)首次觀察了川芎嗪對(duì)肺癌A549細(xì)胞COX-2的作用，結(jié)果顯示川芎嗪能夠抑制A549細(xì)胞COX-2的酶活性和轉(zhuǎn)移瘤組織中COX-2的表達(dá)。
　　 (3)首次揭示了COX-2是川芎嗪抑制肺癌A549細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的重要作用靶點(diǎn)之一。
　　 5.意義
　　 本研究首次揭示了川芎嗪以COX-2為靶點(diǎn)的抗腫瘤作用，對(duì)川芎嗪抗腫瘤作用的分子機(jī)制進(jìn)行了新的闡述，為進(jìn)一步的研究