厄羅替尼聯(lián)合塞來(lái)昔布阻斷EGFR和COX-2信號(hào)途徑抑制肺癌A549細(xì)胞增殖.pdf

1、目的:國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道非小細(xì)胞肺癌組織(NSCLC)常有EGFR和COX-2高表達(dá),并常與肺癌發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物特性有密切關(guān)系。本研究探討表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)抑制劑厄羅替尼(Erlotinib)聯(lián)合環(huán)氧合酶-2(COX-2)抑制劑塞來(lái)昔布(Celecoxib)聯(lián)合干預(yù)肺腺癌A549細(xì)胞后是否具有協(xié)同殺傷作用,并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行初步研究,從而為非小細(xì)胞肺癌治療提供新的思路。
　　 方法:厄羅替尼、塞來(lái)昔布單獨(dú)或聯(lián)合干預(yù)

2、細(xì)胞48h后,倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài);四甲基偶氮唑鹽(MTT)測(cè)定細(xì)胞抑制率;Hoechst33258法、TUNEL和AnnexinV/PI法檢測(cè)細(xì)胞凋亡和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期;免疫熒光檢測(cè)EGFR和COX-2蛋白表達(dá)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以-x±s表示,用SPSS11.5軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、X2檢驗(yàn)和方差分析,P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1、倒置相差顯微鏡下形態(tài)學(xué)觀察
　　 ①未加藥的正常A54

3、9設(shè)為空白對(duì)照組:細(xì)胞形態(tài)正常,細(xì)胞緊密貼壁,邊界清楚透明度高,生長(zhǎng)旺盛,可見(jiàn)各期核分裂相。
　　 ②50μmol/L厄羅替尼單藥組:細(xì)胞體積明顯縮小,細(xì)胞間隙增大,細(xì)胞貼壁減慢,胞內(nèi)出現(xiàn)顆粒,可見(jiàn)細(xì)胞碎片。
　　 ③25μmol/L塞來(lái)昔布單藥組:細(xì)胞略變圓縮小,空泡和顆粒增多,形態(tài)改變,細(xì)胞間隙增大。可見(jiàn)少量的凋亡小體。
　　 ④50μmol/L厄羅替尼+25μmol/L塞來(lái)昔布聯(lián)合用藥組:相比單藥組細(xì)胞明顯

4、皺縮變圓脫落,顆粒增多開(kāi)始碎解,見(jiàn)細(xì)胞碎片和凋亡小體。
　　 2、四甲基偶氮唑鹽(MTT法)檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用:厄羅替尼和塞來(lái)昔布單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用后,應(yīng)用MTT檢測(cè)生長(zhǎng)抑制率提示兩者分別對(duì)A549細(xì)胞的殺傷效應(yīng)呈劑量依賴性和時(shí)間依賴性。單藥厄羅替尼(50μmol/L)、塞來(lái)昔布(25μmol/L)作用48小時(shí)的細(xì)胞抑制率依次為(34.35±2.77)％、(26.66±2.12)％,厄羅替尼(50μmol/L)聯(lián)合塞來(lái)昔布

5、(25μmol/L)組抑制率為(50.33±3.27)％明顯高于單藥組。
　　 3、藥物聯(lián)合治療后的凋亡效應(yīng):Hoechst33258染色法結(jié)果顯示:空白對(duì)照組核形態(tài)均勻,未見(jiàn)邊聚現(xiàn)象,胞內(nèi)染色均一,形狀規(guī)則,細(xì)胞聯(lián)系緊密。而藥物處理組均見(jiàn)細(xì)胞縮小,形態(tài)異常,胞質(zhì)染色較深,熒光增強(qiáng)、染色質(zhì)濃縮、碎片,可見(jiàn)凋亡小體形成。對(duì)照組的凋亡率為(0.78±0.04)％;而聯(lián)合用藥組凋亡率為(63.37±2.12)％,顯著高于單用厄羅替尼組

6、的(32.56±1.67)％和塞來(lái)昔布組的(25.67±1.98)％。
　　 TUNEL染色法:凋亡陽(yáng)性細(xì)胞的判斷:凋亡細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞胞核呈棕黃色著色,細(xì)胞漿不著色。實(shí)驗(yàn)中加藥組均可見(jiàn)凋亡陽(yáng)性細(xì)胞,聯(lián)合加藥組凋亡現(xiàn)象顯著。對(duì)照組的(0.95±0.24)％,聯(lián)合用藥組細(xì)胞凋亡率為(42.13±1.4)％顯著高于單用厄羅替尼組的(32.56±1.67)％和塞來(lái)昔布組的(25.67±1.98)％。
　　 Annexin V/P

7、I法結(jié)果顯示:正常對(duì)照組早期凋亡率為(0.86±1.3)％,50μmol/L厄洛替尼聯(lián)合25μmol/塞來(lái)昔布處理A549細(xì)胞48h后,可見(jiàn)(52.47±2.3)％的細(xì)胞凋亡,明顯高于50μmol/L厄洛替尼、25μmol/塞來(lái)昔布單獨(dú)用藥的細(xì)胞凋亡率分別為(30.24±1.7％)、(22.13±1.2)％。
　　 4、藥物對(duì)細(xì)胞周期的影響:厄羅替尼、塞來(lái)昔布均可以阻滯細(xì)胞周期,引起G1期細(xì)胞比例明顯增加,S期細(xì)胞比例明顯減少。

8、與單藥組相比,聯(lián)合用藥組G0～G1期阻滯作用明顯。
　　 5、免疫熒光法檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞EGFR和COX-2蛋白的影響:A549細(xì)胞中EGFR和COX-2均有表達(dá)。空白對(duì)照組EGFR和COX-2熒光很強(qiáng),可見(jiàn)兩者在A549細(xì)胞中均高表達(dá)。厄羅替尼及塞來(lái)昔布單藥組EGFR和COX-2表達(dá)均減弱,而聯(lián)合用藥后EGFR和COX-2表達(dá)均顯著減弱,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論:厄羅替尼與塞來(lái)昔布聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同抑制細(xì)胞生長(zhǎng),介導(dǎo)細(xì)