中華眼鏡蛇毒組分C體外對(duì)人膠質(zhì)瘤株的作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景和目的: 腦膠質(zhì)瘤是常見(jiàn)的顱內(nèi)腫瘤，占腦惡性腫瘤的50％以上，目前腦膠質(zhì)瘤的治療，主要依賴手術(shù)切除，但是由于腦膠質(zhì)瘤浸潤(rùn)性生長(zhǎng)的特性，使得手術(shù)切除難以達(dá)到臨床治愈的目的，級(jí)別較高的腦膠質(zhì)瘤容易手術(shù)后復(fù)發(fā)或者腦內(nèi)轉(zhuǎn)移。為了達(dá)到良好的治療結(jié)果，化療作為腦膠質(zhì)瘤綜合治療的一項(xiàng)重要手段，有著舉足輕重的作用。但是血腦屏障的存在及腦膠質(zhì)瘤對(duì)化療藥物敏感性的差異等因素，使腦膠質(zhì)瘤化療的臨床效果不能不令人滿意。 提高腦膠質(zhì)瘤的化療效

2、果方法很多，通過(guò)新藥研發(fā)、聯(lián)合用藥、局部用藥甚至個(gè)體化用藥等方法，使得腦膠質(zhì)瘤的化療效果有所提高。但是，迄今為止，腦膠質(zhì)瘤的化療效果仍然不能達(dá)到臨床上防治復(fù)發(fā)的要求。這樣，繼續(xù)研發(fā)新藥成了科研工作者的工作重點(diǎn)之一。為了能夠節(jié)省科研經(jīng)費(fèi)及實(shí)驗(yàn)周期，選擇對(duì)其他系統(tǒng)惡性腫瘤有效的化療藥物進(jìn)行試驗(yàn)篩選，是切實(shí)可行的辦法。中華眼鏡蛇蛇毒組分C是已知的對(duì)多種惡性腫瘤有效的一種生物制劑。本課題的設(shè)計(jì)分為體外部分和體內(nèi)部分，體外部分是用中華眼鏡蛇蛇毒組

3、分C(NajaNajaActraVenomFractionC,N.N.A.V.FC)對(duì)體外培養(yǎng)的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U-251的藥物毒性作用的研究，及用細(xì)胞生物學(xué)、免疫組織化學(xué)、分子生物學(xué)等方法研究該藥物對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U-251的作用機(jī)制；體內(nèi)部分是用U-251瘤株接種到裸鼠，制造皮下荷瘤模型，然后通過(guò)體內(nèi)藥物試驗(yàn)，研究N.N.A.V.FC對(duì)腦膠質(zhì)瘤的作用。為腦膠質(zhì)瘤化療藥物的擴(kuò)展作出探索。本文主要闡述N.N.A.V.FC在體外的藥物作用及

4、機(jī)制部分的研究。 材料和方法: 體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)： 1.實(shí)驗(yàn)采用96孔板體外腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U-251的培養(yǎng)，分別加入N.N.A.V.FC時(shí)，應(yīng)用四唑鹽比色法，觀察中華眼鏡蛇蛇毒組分C對(duì)人膠質(zhì)細(xì)胞瘤株U-251的細(xì)及其他臨床化療藥物，加入藥物后，分別培養(yǎng)24小時(shí)和28小時(shí)，應(yīng)用四唑鹽比色法，觀察N.N.A.V.FC對(duì)人膠質(zhì)細(xì)胞瘤株U-251的細(xì)胞毒作用、量效關(guān)系等，并觀察N.N.A.V.FC與依托泊苷、鬼臼乙叉苷、

5、衛(wèi)萌(替尼泊苷、鬼臼甲叉甙)、順鉑、卡鉑、五氟尿嘧啶等臨床化療藥物的細(xì)胞毒作用差異。 2.96孔板體外培養(yǎng)正常的腦膠質(zhì)細(xì)胞，分別加入不同濃度的N.N.A.V.FC，加入藥物后，培養(yǎng)24小時(shí)，應(yīng)用四唑鹽比色法，觀察N.N.A.V.FC對(duì)人正常膠質(zhì)細(xì)胞的毒性作用、量效關(guān)系等， 毒理學(xué)作用機(jī)制的研究體外24孔板培養(yǎng)的腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤株U-251，加入不同濃度N.N.A.V.FC，形態(tài)學(xué)觀察；3ug/ml藥物濃度作用12小時(shí)后，固定

6、，以免疫組織化學(xué)檢測(cè)Fas,FasL、P53、bax/bcl2的表達(dá)；分別在3.0、4.5、15小時(shí)3個(gè)濃度點(diǎn)，培養(yǎng)4小時(shí)，在超凈工作臺(tái)上提取DNA，行DNALADDER實(shí)驗(yàn)。 結(jié)果: 1.N.N.A.V.FC組分在濃度為1.5μg/ml時(shí)，即對(duì)傳代細(xì)胞株產(chǎn)生抑制作用，劑量越大，抑制作用越明顯，本實(shí)驗(yàn)4.5ug/ml時(shí)，24h及48h的抑制率分別為57.4％和59％.24h及48hIC50分別為5.76和7.19ug/m

7、l。 2.分析比較U-251細(xì)胞系對(duì)各藥物的敏感性，對(duì)U-251的IC50，低濃度時(shí)N.N.A.V.FC的作用比替尼泊苷強(qiáng)(t＜0.05)；血漿峰濃度時(shí)的N.N.A.V.FC對(duì)U-251膠質(zhì)瘤細(xì)胞毒性作用強(qiáng)于血漿峰濃度時(shí)依托泊苷、鬼臼乙叉苷、順鉑、卡鉑、五氟尿嘧啶(P＜0.01)。 3.N.N.A.V.FC濃度與U-251膠質(zhì)瘤細(xì)胞損傷程度呈正比，N.N.A.V.FC濃度在1.5ug/ml以下，U-251膠質(zhì)瘤細(xì)胞的輪廓

8、尚清晰，細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯變化，胞體折光性好，細(xì)胞突起明顯，N.N.A.V.FC濃度達(dá)3ug/ml時(shí)，細(xì)胞核固縮，細(xì)胞突起減少，胞體折光性減弱，胞漿內(nèi)可見(jiàn)有顆粒，當(dāng)N.N.A.V.FC濃度達(dá)4.5ug/ml時(shí)，U-251膠質(zhì)瘤細(xì)胞輪廓變模糊，細(xì)胞變圓離壁，突起減少，變短，胞漿內(nèi)顆粒明顯增多，部分細(xì)胞漲大破裂。 4.Fas,FasL、P53、Bcl-2/Bax均有陽(yáng)性表達(dá)，其中P53陽(yáng)性表達(dá)率較高。 5.DNALADDER實(shí)驗(yàn)

9、中有凋亡條帶的出現(xiàn)，其中4.5ug/ml段條帶最為清晰。 結(jié)論: 1.在本實(shí)驗(yàn)中，N.N.A.V.FC組分能有效抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞株的生長(zhǎng)，抑制作用與濃度呈正相關(guān)，與臨床膠質(zhì)瘤化療藥相比較，N.N.A.V.FC是有效的、能抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物。 2.形態(tài)學(xué)的觀察結(jié)果顯示，N.N.A.V.FC的改變，瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變同IC50改變一致。 3.免疫組織化學(xué)結(jié)果與DNALADDER實(shí)驗(yàn)證實(shí)，N.N.A.V.F