舟山眼鏡蛇毒細(xì)胞毒素的克隆、表達(dá)及免疫學(xué)活性鑒定.pdf

1、目的：蛇毒是一種成分復(fù)雜的天然生物毒素，含有多種酶類和藥理活性多肽，就眼鏡蛇(Naja naja atra)蛇毒而言，含有細(xì)胞毒素(cytotoxin，CTX)、神經(jīng)毒素(neurotoxin，NT)和多種酶類等，其中CTX在體外對多種瘤細(xì)胞具有直接溶解作用。從蛇毒中分離細(xì)胞毒素資源有限，成本高，技術(shù)難，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)難統(tǒng)一。本文擬應(yīng)用基因克隆的方法，構(gòu)建舟山眼鏡蛇毒細(xì)胞毒素(cytotoxin，CTX)原核表達(dá)載體(pET42α(+)-CT

2、X)，并在大腸桿菌中表達(dá)CTX重組蛋白。旨在為開發(fā)眼鏡蛇毒細(xì)胞毒素作為抗腫瘤藥物提供藥學(xué)和藥理學(xué)資料；也為深入研究細(xì)胞毒素結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系創(chuàng)造條件。
　　 方法：從舟山眼鏡蛇毒中分離純化細(xì)胞毒素(CTX)，測定N-末端及C-末端的氨基酸序列并據(jù)此設(shè)計引物，含KpnⅠ酶切位點、SacⅠ酶切位點。P1:5'-GGGGTACCAAAACTCTGCTGCTGACCTTG-3'，P2:5'-CGAGCTCTCAGTTGCATCTGTCTGT

3、ATTG-3'。以提取的舟山眼鏡蛇毒腺總RNA為模板，RT-PCR方法合成擴增其中的細(xì)胞毒素基因序列(CTX cDNA)。將CTX cDNA定向克隆到原核表達(dá)載體pET42α(+)中，獲得重組DNA(pET42α(+)-CTX)，經(jīng)KpnⅠ/SacⅠ酶切鑒定后，熱激轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α。獲得單克隆(CTX-pET42α(+)-DH5α)增殖后，抽提質(zhì)粒，并用KpnⅠ and SacⅠ雙酶切圖譜分析、T7引物PCR和DNA序列測定，鑒定

4、陽性轉(zhuǎn)化子DNA序列，該序列與文獻報導(dǎo)的蛇毒CTX基因序列一致；將鑒定確認(rèn)的陽性轉(zhuǎn)化子重組質(zhì)粒(pET42α(+)-CTX)，應(yīng)用CaCl2法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌表達(dá)菌E.coli BL21(DE3)中，測序鑒定。IPTG誘導(dǎo)CTX融合蛋白表達(dá)，SDS-PAGE凝膠電泳鑒定表達(dá)產(chǎn)物；GSTrap FF親和層析純化融合蛋白CTX，Western-blotting方法鑒定表達(dá)產(chǎn)物的抗原性。
　　 結(jié)果：⑴RT-PCR擴增得到的CTX cD

5、NA243bp左右，與預(yù)期的CTX基因大小基本一致。⑵構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET42α(+)-CTX，經(jīng)雙酶切、T7引物PCR和DNA序列測定，證實CTX基因已正確插入質(zhì)粒載體的多克隆位點。得知CTX的cDNA大小約為243bp。⑶在大腸桿菌E.coli BL21(DE3)中成功表達(dá)融合蛋白CTX，SDS-PAGE凝膠電泳顯示CTX以可溶性蛋白及包涵體形式存在，融合蛋白分子量為：37.9kD。⑷純化得到融合CTX，具有眼鏡蛇毒細(xì)胞毒素的抗原