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文檔簡介
1、本課題以牛β-酪蛋白(β-casein,β-CN)、牛κ-酪蛋白(κ-casein,κ-CN)和大腸桿菌O157:H7菌體為抗原,經(jīng)雞體和兔免疫,獲得源于雞卵黃和兔血清的兩類抗體,并對它們的化學(xué)穩(wěn)定性和與抗原的結(jié)合特性進(jìn)行了對比研究,并將特性較優(yōu)的抗體做了膠體金標(biāo)記,標(biāo)記效果良好。
1、兩類特異性抗體的制備:以兩種乳源蛋白和一種微生物菌體為抗原,分別免疫產(chǎn)蛋雞和新西蘭大白兔,獲得高免雞蛋和抗血清,采用水稀釋凍融法、膜分離、
2、鹽析和親和層析等純化步驟,可以制備得到純度為90%以上的卵黃抗體(Immunoglobulin ofyork,IgY),采用三級鹽析和親和層析結(jié)合的方法,可從血清中獲得純度在95%以上的血清抗體(主要成分為Immunoglobulin G,IgG)。
2、兩類抗體的特性比較:以抗κ-CN抗體為代表,對比研究了IgY與IgG兩類抗體對熱和酸堿的穩(wěn)定性,結(jié)果表明IgG抗體的熱穩(wěn)定性較IgY強(經(jīng)30min熱處理后IgG活性下降
3、50%溫度為70℃,IgY為63℃),同時,酸堿穩(wěn)定性IgG也更強(IgG的穩(wěn)定pH范圍為2~11,IgY為3~10)。采用硫氰酸銨洗脫法和尿素洗脫法測定了三對抗體與其相應(yīng)抗原的結(jié)合情況,用尿素洗脫法測得的抗β-CN、κ-CN和O157:H7IgY的相對親和力指數(shù)分別為79.1%、80.2%、90.4%,高于IgG的55.7%、58.3%、56.4%,這同硫氰酸銨洗脫所得的濃度抗體保留率曲線共同說明了三種特異性IgY抗體與對應(yīng)抗原的親和
4、力比IgG強。本實驗還研究了這三組抗體與相近抗原的交叉反應(yīng)情況,結(jié)果顯示兩組抗乳源蛋白的抗體與相近抗原存在非常明顯的交叉反應(yīng),而抗大腸桿菌O157:H7抗體特異性較好,僅與普通大腸桿菌存在較弱的交叉反應(yīng)。利用相近抗原κ-CN和乳清粉兩種相近抗原對抗β-CN抗體進(jìn)行修飾后,交叉反應(yīng)明顯下降;用3-CN和乳清粉以同樣的方式處理后的抗κ-CN抗體也有同樣的效果。比較而言,IgY與相近抗原的交叉反應(yīng)要小于IgG。
3、抗體的膠體金
5、標(biāo)記及其效果評價:利用光譜掃描的方法,篩選得到最佳的膠體金制備方法為抗壞血酸還原法,并得到其最佳制備條件為:100ml0.01%四氯金酸溶液中1%抗壞血酸添加量為1ml,反應(yīng)時間為5min。選用三種IgY抗體進(jìn)行膠體金標(biāo)記,先確定抗β-CN、κ-CN、O157:H7 IgY抗體蛋白的最佳標(biāo)記量為39μl/ml、26μl/ml、26μl/ml(抗體樣液體積/膠體金體積),pH為5.5。在最佳標(biāo)記條件下對這三種抗體進(jìn)行膠體金標(biāo)記,標(biāo)記率分別
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