電鏡膠體金標(biāo)記方法

1、（1）超薄切片厚50～70nm左右，載于200～300網(wǎng)孔的鎳網(wǎng)上。（2）置1%H2O2內(nèi)10min至1h（視樹(shù)脂的硬度和切片的厚度而定），以去鋨酸和增進(jìn)樹(shù)脂穿透性，有利抗體進(jìn)入。如切片很薄或于低溫包埋時(shí)，此步可省略。操作時(shí)，滴入1%H2O2液1滴于蠟板上，將網(wǎng)的載片面輕浮于液滴上。對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)切片，有主張以1%過(guò)碘酸鉀（KIO4）代替H2O2的。（3）雙蒸水洗3次，每次10min，第1，2次洗法如（2），浮于液滴上，第3次以盛雙蒸水

2、的注射器沿鎳網(wǎng)面沖洗，水流應(yīng)有適當(dāng)壓力，但不宜過(guò)高強(qiáng)，用濾紙?jiān)诰W(wǎng)緣將水吸干。（4）浮于正常羊血清（1：50～1：100）滴上，室溫30～60min，以飽和固定劑中的游離醛基占據(jù)非特異性結(jié)合部位。（5）PBS漂洗3min，洗1次（有人主張不洗）。（6）濾紙吸干，孵育于第一抗體血清滴上，先室溫預(yù)孵1h，再置于4℃24～36h。（7）PBS漂洗3min，3次。（8）PBS（內(nèi)含1%的牛血清白蛋白）pH8.2中，5min，此步為膠體金結(jié)合作準(zhǔn)備

3、。（9）膠體金標(biāo)記抗體液1：30～1：100，淡紅色為適宜稀釋液，室溫孵育10min至1h。（10）雙蒸水洗3min，3次。如作雙重染色，則應(yīng)將鎳網(wǎng)翻過(guò)來(lái)，用另一類抗體血清，重復(fù)上述步驟（2）～（10）。膠體金標(biāo)記蛋白A技術(shù)（ProteinAgoldtechniquePAg法）PAg復(fù)合物制備方法簡(jiǎn)便，作為第二抗體，無(wú)種屬特異性，可以免去不同種屬動(dòng)物要制備不同的特異性免疫球蛋白。PAg復(fù)合物與包埋劑和細(xì)胞成分都極少發(fā)生非特異性的交互作用

4、，蛋白A和金粒間非共價(jià)的結(jié)合特性既不影響蛋白A的活性，又能保持高度的穩(wěn)定性，PAg復(fù)合物分子最小易于穿透組織。PAg復(fù)合物的原液在4℃可保存達(dá)一年之久。電鏡水平的電鏡水平的PAgPAg染色法染色法PAg法在電鏡技術(shù)的應(yīng)用原則是二步標(biāo)記法，可用于包埋前和包埋后染色。其主要區(qū)別于一般膠體金免疫染色在：①須1%卵白蛋白－PBs（pH7.4）或1%卵白蛋白—0.05mollTris緩沖液（pH7.4）來(lái)封閉非特異性的結(jié)合部位，而不是采用羊或其它

5、的動(dòng)物的正?？寡?，因?yàn)镻Ag復(fù)合物能夠與正常血清組中的Ig結(jié)合，從而給出假陽(yáng)性結(jié)果；②在應(yīng)用第一抗血清孵育和PBS沖洗后作第二抗血清即PAg復(fù)合物孵育前的準(zhǔn)備時(shí)，應(yīng)用的PBS或TBS的pH應(yīng)變更為pH8.2。其它可參照本節(jié)中包埋后染色法進(jìn)行。液體配制：1、膠體金稀釋液配方：膠體金稀釋液配方：（PH＝8.2）的0.02mo1／LTrisTBS緩沖液，加入試劑級(jí)卵清白蛋白至1％。｛免疫電鏡按1：2050稀釋，淡紅色為適宜稀釋液膠體金稀釋后

6、應(yīng)于當(dāng)天使用，未用完的應(yīng)該丟棄。（免疫膠體金說(shuō)明書(shū)）｝2、清洗液：清洗液：0.5mol／L，pH7.4TrisHcl緩沖液：Tris，60.57g，1mol／LHcl約420m1，調(diào)pH值至7.4，最后加雙蒸水至1000m1，此為儲(chǔ)備液。0.05mo10.05mo1／LTrisTris緩沖生理鹽水：氯化鈉8.59g；0.5mo1／L，pH7.4TrisHcl緩沖液100m1；加雙蒸水至1000m1，調(diào)pH值至7.4。0.02mo10.0

7、2mo1／LTrisLTris緩沖生理鹽水：氯化鈉8.59g；o.5mo1／L，pH7.4TrisHcl緩沖液40m1，加雙蒸水至l000m1，調(diào)pH值至8.2。3、H2O2的配制:3%H2O24、8％過(guò)碘酸鈉水溶液5、封閉液：將免疫組織化學(xué)技術(shù)與電子顯微鏡技術(shù)相結(jié)合，則可以利用電子顯微鏡高分辨率的優(yōu)點(diǎn)，在超顯微結(jié)構(gòu)水平定位細(xì)腦內(nèi)的特異性抗原。為疾病的病因、發(fā)病機(jī)理、組織來(lái)源等方面的探索研究，為提高疾病的認(rèn)識(shí)與診斷提供可靠的手段。1)試

8、劑配制：(1)4％多聚甲醛一0.01％戊二醛溶液：多聚甲醛4g，0.2m01／L二甲砷酸鈉緩沖液(內(nèi)含0.2mol／L蔗糖，0.4mmo1／LCaCl2)50m1，20％戊二醛40ul，雙蒸水加至100m1。(2)0.5mol／L，pH7.4TrisHcl緩沖液：Tris，60.57g，1mol／LHcl約420m1，調(diào)pH值至7.4，最后加雙蒸水至1000m1，此為儲(chǔ)備液。(3)0.05mo1／LTris緩沖生理鹽水：氯化鈉8.59g

9、；0.5mo1／L，pH7.4TrisHcl緩沖液100m1；加雙蒸水至1000m1，調(diào)pH值至7.4。(4)0.02mo1／LTris緩沖生理鹽水：氯化鈉8.59g；o.5mo1／L，pH7.4TrisHcl緩沖液40m1，加雙蒸水至l000m1，調(diào)pH值至8.2。(5)0.5mo1／L，TritonTris緩沖生理鹽水：Tritonx100l0m10.5mo1／L，pH7.4TrisHcl緩沖液100m1，加雙蒸水至l000m1，調(diào)

10、pH值至7.4。2)具體步驟:(1)0.05mo1／LTBS(pH7.4)洗5min3次。(3)1：5正常羊血清(0.05mo1／LTBSPH7.4)37℃孵育lh，阻斷非特異性吸附，吸去多余血清，不洗。(4)特異性一抗(抗體稀釋度較常規(guī)免疫組化低l倍)室溫孵育24h。(5)0.05mo1／LTBSpH7.4，洗5min3次。(6)0.02mo1／LTBSPH8.2，洗5min3次。(7)1：5正常羊血清(0.02mo1／LTBSpH8

11、.2)37℃孵育lh，再次阻斷非特異性吸附，吸去多余血清，不洗。(8)生物素化膠體金標(biāo)記二抗(原液)37℃孵育2h。(9)0.02mo1／LTBSpH8.2，洗5min3次。(10)0.05mo1／LTBSpH7.4，洗5min3次。(11)最后切片浸于o05m01／LTBSpH74緩沖液中，送電鏡室處理.無(wú)DNA酶的胰RNA酶將胰RNA酶溶解于10mmolLTrisHcl(PH7.5)15mmolLNaCl中配成10mgml的濃度與1

12、00度加熱15分鐘緩慢冷卻至室溫分裝成小份－20度保存.病毒液體的膠體金技術(shù)：（自：傅倉(cāng)生，膠體金免疫電鏡技術(shù)用于煙草花葉病毒的檢測(cè)，植物病理學(xué)報(bào)，VoL24，No4，353—355）1.3.1外標(biāo)記標(biāo)本制備：(1)以帶膜銅網(wǎng)蘸取純化病毒懸液，PBS沖洗。(2)在相應(yīng)的抗血清中室溫孵育20分鐘，PBS沖洗。(3)在PAg(1：50稀釋)中室溫孵育20分鐘，PBS沖洗。(4)1％醋酸鈾負(fù)染，H500電鏡觀察，拍照。內(nèi)標(biāo)記標(biāo)本制備：(1)以

13、感染煙草花葉病毒的普通煙葉的試料，電鏡常規(guī)制樣，超薄切片。(2)在TMV抗血清中室溫孵育l小時(shí)，PBS沖洗數(shù)次。(3)在PAg(1：50稀釋)中室溫孵育1小時(shí)，PBS沖洗數(shù)次，三蒸水沖洗數(shù)次。(4)醋酸鈾一檸檬酸鉛雙染色，H500電鏡觀察，拍照。（自：翟雷，樸曉萍，潘萍等。微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展，1995，24（3）：1719。免疫膠體金試劑的制備及應(yīng)用膠體金免疫電鏡技術(shù)檢測(cè)戊型肝炎病毒）取樣品100ul分別于微量離心管，各加100ul鼠抗