汞(Ⅱ)和菊酯類農(nóng)藥的膠體金檢測技術(shù)研究.pdf

1、本研究利用金標層析試紙技術(shù)，以核酸適體和單克隆抗體為識別探針，建立了快速檢測Hg2+和高效氯氰菊酯農(nóng)藥的方法。
　　一、基于核酸適配體檢測金屬Hg(Ⅱ)的膠體金層析技術(shù)研究
　　利用“指數(shù)式富集配體進化系統(tǒng)(systematic evolution of ligands by exponentialenrichment，SELEX)”技術(shù)篩選獲得并改造的核酸適體為標記探針，應用金標層析試紙技術(shù)，建立了快速檢測Hg2+的膠體金

2、試紙條方法。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　1.膠體金的制備與優(yōu)化
　　采用檸檬酸三鈉還原法，制備出10nm，15nm，20nm，40nm膠體金，并優(yōu)化膠體金的最佳離心速度，實驗結(jié)果表明:10nm，15nm，20nm，40nm的膠體金的最佳離心速度分別是:10000rpm，10000rpm，8000rpm，6000rpm，離心時間15min。
　　2.基于競爭抑制原理的金標試紙條的設計與組裝
　　檢測T線設計:以單

3、鏈核酸適體的互補序列為探針，與目標化合物Hg2+競爭結(jié)合金標核酸適體N5，以競爭結(jié)合導致金顆粒沉積顯色，達到檢測目標化合物目的。
　　質(zhì)控C線設計:以對目標化合物無識別作用的核酸適體的互補序列poly-A為探針，與無識別作用的核酸適體結(jié)合導致金顆粒沉積顯色，設計試紙條的質(zhì)控線。
　　結(jié)果表明，設計的互補探針中，Hg2+不能競爭核酸適體N5的完全互補序列N5-C-5B，但對部分互補序列MB-1-5具有很好的競爭效果，試驗選用M

4、B-1-5。
　　3.試紙條的優(yōu)化
　　(1) C/T線包被位置優(yōu)化。實驗結(jié)果表明:T線的最佳包被位置在距離NC膜下邊緣9mm處，C線在其上端平行距離4-5mm處。
　　(2)競爭反應劑量的優(yōu)化。通過改變金標結(jié)合物和MB-1-5的包被量，達到優(yōu)化檢測靈敏度的目的。將活化的1.0OD的核酸適體N5加到5mL膠體金中，濃縮5倍，設計梯度用量包被金標墊;將1.0OD MB-1-5與鏈霉親和素反應后，用PBS定容至500μL，

5、設計梯度用量包被T線;結(jié)果表明，試紙條的最佳競爭反應包被量為:金標結(jié)合物3μL，MB-1-51.5-2.0μL，對Hg2+裸眼觀察檢測靈敏度為3μg/mL。
　　(3)最佳膠體金標記粒徑的選擇優(yōu)化。將不同粒徑的膠體金與核酸適體結(jié)合，用同樣的方法制作試紙條，比較試紙條的顯色效果和檢測靈敏度，篩選出檢測效果最好的膠體金標記粒徑。結(jié)果表明:粒徑范圍為15-20nm的膠體金檢測效果最好，實驗選用粒徑15nm的膠體金。
　　二、基于抗

6、體檢測高效氯氰菊酯農(nóng)藥的膠體金層析技術(shù)研究
　　本研究使用以PBA-BSA為免疫原制備的抗擬除蟲菊酯類農(nóng)藥單克隆抗體，結(jié)合膠體金層析技術(shù)，研制快速檢測高效氯氰菊酯農(nóng)藥的試紙條。主要研究結(jié)果如下:
　　經(jīng)方法優(yōu)化后，選用15nm的膠體金標記抗體，金標抗體終濃度為:1.5mg/mL，金標墊包被量為2μL;T線包被PBA-OVA，包被濃度為0.25mg/mL，包被量0.8μL;C線包被的是羊抗鼠IgG，包被濃度為0.1mg/mL，