約氏瘧原蟲子孢子侵入相關(guān)基因分析及235kDa棒狀體蛋白研究.pdf

1、蚊媒傳播的瘧疾是一種嚴(yán)重危害人類健康的熱帶傳染病，在全世界人群中具有很高的發(fā)病率和致死率。近年來瘧原蟲多藥抗性株的出現(xiàn)與迅速擴散，以及蚊媒對殺蟲劑耐受性的增加，目前又無有效的抗瘧疫苗，給瘧疾防治工作帶來很大的困難。傳統(tǒng)方法已難于控制該病的流行，迫切需要為瘧疾的防治工作提供新的方法和手段。瘧疾是由蚊蟲叮咬而傳播，瘧原蟲子孢子一旦進入血循環(huán)，數(shù)分鐘后便隨血流跨過肝血竇枯否氏細胞(Kuppfercell，KC)后主動粘附、迅速侵入肝細胞，并進

2、行紅外期增殖，然后進入紅細胞，導(dǎo)致瘧疾的發(fā)作。子孢子侵入肝細胞是瘧疾感染的關(guān)鍵，而阻斷蟲體的侵入，即可防止瘧疾感染，紅外期阻斷疫苗旨在阻斷子孢子侵入宿主肝細胞，防止瘧原蟲紅內(nèi)期的發(fā)育，是瘧疾疫苗的重要組成部分。 唾液腺子孢子感染性受發(fā)育調(diào)節(jié)。正常情況下，中腸內(nèi)卵囊成熟后破裂，子孢子逸出，經(jīng)血淋巴移行到唾液腺后2d，發(fā)育成為具有感染性的子孢子。因此研究瘧原蟲具有侵入肝細胞能力的唾液腺子孢子與不具侵入肝細胞能力的卵囊子孢子之間的差異

3、分子具有重要意義。通過對瘧原蟲子孢子不同時相點侵入相關(guān)基因和蛋白的研究與鑒定，將有助于認識瘧原蟲生長發(fā)育的分子機制，可為瘧疾的防治提供分子理論依據(jù)，提供藥物和疫苗新的靶目標(biāo)，為采取防治策略戰(zhàn)勝瘧疾打下了堅實的基礎(chǔ)。 在后基因組時代，對基因功能的分析已成為當(dāng)前的主要任務(wù)。而功能基因組學(xué)最大的技術(shù)挑戰(zhàn)是關(guān)于蛋白表達的分析(蛋白質(zhì)組學(xué))。在本實驗室前期的研究中，應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)的二維凝膠電泳(two-dimensionalgelelec

4、trophoresis，2-DE)技術(shù)、基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(matrix-assistedlaserdesorption/inoizationtimeofflyingmassspectrometry，MALDI-TOF-MS)分析技術(shù)和蛋白質(zhì)信息學(xué)等方法對約氏瘧原蟲卵囊子孢子和唾液腺子孢子這兩個不同發(fā)育時期蟲體的可溶性蛋白進行了分析研究。結(jié)果顯示相對于卵囊子孢子，在唾液腺子孢子中確定比較明顯的差異蛋白點有六個，分別為PyD

5、p1～6(Plasmodiumyoeliidifferentialprotein1～6)。這些差異蛋白點主要為一些膜蛋白、表面蛋白和運動相關(guān)的蛋白。推測這些蛋白可能與瘧原蟲子孢子黏附、侵入肝細胞相關(guān)，可能為新的阻斷策略和瘧疾多價亞單位疫苗的靶目標(biāo)。因此，加強這些差異表達蛋白的研究可為分子水平上篩選和發(fā)展抗瘧藥物和促進疫苗研制奠定理論基礎(chǔ)。 對約氏瘧原蟲子孢子差異表達蛋白的結(jié)果進行研究分析發(fā)現(xiàn)，差異蛋白點PyDp1(pI：pH4，

6、MW：24×103)與瘧原蟲頂端復(fù)合體棒狀蛋白Py235(Plasmodiumyoelii235kDarhoptryproteins，Py235)相匹配。Py235是一組能夠協(xié)助瘧原蟲侵入宿主細胞，與瘧原蟲的侵襲力密切相關(guān)的高分子量蛋白(235kDa)。在紅內(nèi)期，Py235蛋白參與對紅細胞進行選擇性侵入，并在多個不同侵入階段均有表達。Py235存在于唾液腺子孢子中，推測其可能與子孢子侵入肝細胞相關(guān)。 因此本實驗以斯氏按蚊-約氏瘧

7、原蟲為模型，在本實驗室的飼養(yǎng)條件下，對目前較明確的瘧原蟲子孢子侵入相關(guān)基因進行定性及半定量分析，以確定采集子孢子樣本的最佳時相點。再從唾液腺子孢子期表達的差異蛋白中選擇差異蛋白點PyDp1為研究基礎(chǔ)，結(jié)合生物信息學(xué)技術(shù)對實驗獲得的肽質(zhì)量指紋圖譜(peptidemassfingerprint，PMF)進行分析鑒定。參考約氏瘧原蟲235kDa棒狀體蛋白的氨基酸序列及其相對應(yīng)的核酸序列，利用primer5.0軟件設(shè)計Py235引物，經(jīng)RT-P

8、CR方法與T-A克隆技術(shù)及核酸測序從約氏瘧原蟲子孢子中克隆到Py235基因部分序列，并在此基礎(chǔ)上對Py235基因進行原核表達研究，同時在基因水平利用DNA斑點雜交對Py235基因在唾液腺子孢子的表達進行定性分析，從而為進一步研究提供理論依據(jù)。 其實驗內(nèi)容和結(jié)果主要包括以下三個方面： 1、在約氏瘧原蟲-斯氏按蚊模型的基礎(chǔ)上，通過建立RT-PCR方法并結(jié)合Qantity-One凝膠分析軟件，對蚊體內(nèi)約氏瘧原蟲卵囊子孢子發(fā)育為

9、唾液腺子孢子不同時相點的環(huán)子孢子蛋白(circumsporozoiteprotein，CSP)與紅細胞結(jié)合蛋白(apicalmembraneantigen-erythrocyte-binding-likeprotein，MAEBL)基因表達進行檢測。結(jié)果提示，按蚊體內(nèi)子孢子發(fā)育過程中CSP和MAEBL表達量的持續(xù)增加，并在唾液腺子孢子中達到峰值。隨著子孢子發(fā)育的越成熟，基因表達量越高。這為研究其它侵入相關(guān)基因的表達奠定了理論基礎(chǔ)。

10、 2、本研究以唾液腺子孢子差異蛋白點PyDp1為研究基礎(chǔ)，結(jié)合生物信息學(xué)技術(shù)對實驗獲得的肽質(zhì)量指紋圖譜進行分析鑒定，獲得Py235棒狀體蛋白氨基酸序列及對應(yīng)的核酸序列，參考這些序列結(jié)果，利用primer5.0軟件設(shè)計Py235引物。應(yīng)用RT-PCR方法及定向克隆技術(shù)和pET表達系統(tǒng)，構(gòu)建了原核表達載體pET28a(+)-Py235以及工程菌株XL1-Blue-pET28a(+)-Py235。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，工程菌株XL1-Blue-p

11、ET28a(+)-Py235成功表達了以包涵體形式存在的Py235融合蛋白。為進一步深入的分析該蛋白的二級結(jié)構(gòu)、空間構(gòu)象及功能結(jié)構(gòu)域等研究提供了基礎(chǔ)。 3、以獲得的Py235基因測序結(jié)果設(shè)計特異的寡核苷酸探針并在5'端標(biāo)記地高辛，通過地高辛標(biāo)記的Py235基因探針與唾液腺子孢子DNA進行斑點雜交反應(yīng)。結(jié)果顯示Py235基因探針可以和相應(yīng)的唾液腺子孢子基因組反應(yīng)，并且有比較好的特異性和敏感性，進一步證實了目的基因的存在。