瑟氏泰勒蟲p33基因與牛IL-18基的串聯(lián)表達(dá).pdf

1、瑟氏泰勒蟲（Theileria sergenti）是泰勒科、泰勒屬的血液原蟲，寄生在紅細(xì)胞內(nèi)。感染泰勒蟲的牛主要表現(xiàn)為慢性貧血、高熱、消瘦和淋巴結(jié)腫大等臨床癥狀，感染泰勒蟲的牛只由于貧血導(dǎo)致免疫力下降，極易引起其他血液性疾病的病原體的繼發(fā)感染，進(jìn)而導(dǎo)致死亡率的升高，給養(yǎng)牛產(chǎn)業(yè)造成不可避免的經(jīng)濟(jì)損失。近年來，隨著中國牛養(yǎng)殖業(yè)的蓬勃發(fā)展，瑟氏泰勒蟲的發(fā)病率在全國范圍內(nèi)的各個地區(qū)呈以驚人的速度呈上升趨勢，給全國各地區(qū)的養(yǎng)牛產(chǎn)業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)威

2、脅。因此，有效控制瑟氏泰勒蟲的發(fā)病率成為當(dāng)務(wù)之急。本試驗(yàn)將瑟氏泰勒蟲主要表面抗原 p33基因與牛白細(xì)胞介素18(IL-18)基因進(jìn)行重組表達(dá)，結(jié)果表明表達(dá)出的重組蛋白IL-18-p33具有相當(dāng)好的反應(yīng)原性。
　　瑟氏泰勒蟲的p33基因是瑟氏泰勒蟲的主要表面蛋白之一，能夠引起宿主的良好的特異性免疫反應(yīng)。根據(jù) GenBank上已經(jīng)發(fā)表的p33基因序列[GenBank:DQ078264.1]白細(xì)胞介素18基因序列（IL-18）[GenB

3、ank: EU574909.1]分別設(shè)計(jì)兩對特異性引物。提取感染瑟氏泰勒蟲牛的陽性抗凝血液DNA，并以血液DNA為模板應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（即PCR技術(shù)）擴(kuò)增得到大小為821 bp大小左右的目的片段。提取pMD-18-T-IL-18質(zhì)粒DNA，以該質(zhì)粒DNA為模板，通過PCR技術(shù)，得到大小為627 bp目的片段。應(yīng)用SOE-PCR技術(shù)將兩段基因串聯(lián)，得到串聯(lián)基因IL-18-p33，大小為1416 bp。將經(jīng)SOP-PCR技術(shù)得到的串聯(lián)

4、基因片段與pMD-19-T simple載體連接，然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌的克隆菌種DH5α。提取質(zhì)粒DNA，質(zhì)粒DNA經(jīng)過PCR、BamHⅠ，XhoⅠ雙酶切和測序確定串聯(lián)基因 IL-18-p33成功與 pMD-19-T simple載體連接后，將該重組質(zhì)粒命名為pMD-19T-IL18-p33。將質(zhì)粒pMD-19T-IL18-p33和原核表達(dá)載體pGEX-4T1經(jīng)過BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，分別回收酶切后的IL18-p33和pGEX-4T

5、1的目的條帶，然后進(jìn)行16℃過夜連接，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌表達(dá)的菌株 BL21，提取質(zhì)粒 DNA后進(jìn)行質(zhì)粒 PCR鑒定和 BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切鑒定，并將其命名為BL21-pGEX4T1-IL18-p33。對 BL21-pGEX4T1-IL18-p33進(jìn)行1/1000濃度的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。將誘導(dǎo)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分析，結(jié)果在66.4 kDa與97.2 kDa之間出現(xiàn)一條79 kDa左右大小條帶，且與預(yù)期結(jié)果大小相符。