布魯氏菌BP26、OMP16、CP39、SP41和eryC基因的原核表達(dá)以及檢測(cè)血清抗體的間接ELISA方法的建立.pdf

1、布魯氏菌病(Brucellosis)是由布魯氏菌(Brucella)侵入機(jī)體引起的人畜共患傳染病，感染動(dòng)物主要表現(xiàn)為流產(chǎn)和不孕不育等癥狀。近年來(lái)，布魯氏菌病在我國(guó)部分地區(qū)仍然對(duì)當(dāng)?shù)氐男竽翗I(yè)和人類健康造成較大的危害，及時(shí)做出快速準(zhǔn)確的診斷是防治和根除該病的關(guān)鍵。目前，我國(guó)在布魯氏菌病防控工作中主要采用虎紅平板凝集試驗(yàn)、試管凝集試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)等傳統(tǒng)血清學(xué)方法進(jìn)行檢測(cè)，因此有必要建立一種高通量的、快速準(zhǔn)確的檢測(cè)布魯氏菌抗體的ELISA方法

2、。本研究通過(guò)原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了布魯氏菌的BP26、OMP16、CP39、SP41和eryC這5個(gè)特異性蛋白，并對(duì)其作為檢測(cè)用抗原的可行性進(jìn)行了研究，最終選定重組周質(zhì)蛋白BP26作為包被抗原，初步建立了檢測(cè)牛布魯氏菌病血清抗體的間接ELISA方法。
　　一、布魯氏菌BP26、OMP16、CP39、SP41和eryC基因的原核表達(dá)
　　根據(jù)羊種布魯氏菌M5(B.melitensis M5)的BP26、OMP16、CP39、SP4

3、1和eryC基因序列設(shè)計(jì)引物，用PCR方法擴(kuò)增目的片段，大小分別為868 bp、556 bp、732 bp、1329 bp和985 bp，然后把目的片段分別連接到克隆載體pMD18-T，測(cè)序確認(rèn)后再連接到表達(dá)載體pET-28a(+)。將酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，得到重組蛋白，大小分別約為32 kDa、21 kDa、30 kDa、51 kDa和38 kDa，且均為包涵體表達(dá)。優(yōu)化的表達(dá)條件為:37℃下

4、，220 rpm搖振培養(yǎng)，IPTG終濃度1 mM，誘導(dǎo)5h。
　　用His親和層析法對(duì)BP26、OMP16、CP39、SP41和eryC這5種重組蛋白進(jìn)行純化，收獲的純化產(chǎn)物濃度分別為1.0 mg/mL、2.4 mg/mL、3.5 mg/mL、1.3 mg/mL、1.7 mg/mL。用Western blotting試驗(yàn)鑒定5種重組蛋白的免疫反應(yīng)性，結(jié)果表明5種重組蛋白均能與牛布魯氏菌病陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，只是反應(yīng)的強(qiáng)度有所不

5、同，其中以重組蛋白BP26反應(yīng)信號(hào)最強(qiáng)。
　　二、檢測(cè)牛血清中布魯氏菌抗體的間接ELISA方法的建立
　　將親和層析純化的重組蛋白BP26、OMP16、CP39、SP41和eryC分別以0.5μg/mL、4μg/mL、3μ/mL、4μg/mL、2μg/mL包被酶標(biāo)板，檢測(cè)48份牛血清樣品，并與Pourquier(@)ELISA試劑盒的平行檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，敏感性分別為90.9％、90.1％、97.％、90.1％和90.1％，

6、特異性分別為80％、80％、73.3％、73.3％和53.3％。5種重組蛋白間接ELISA分別檢測(cè)由虎紅平板凝集試驗(yàn)、試管凝集試驗(yàn)、Pourquier(@) ELISA試劑盒檢測(cè)均為陽(yáng)性牛血清樣品20份、陰性牛血清樣品8份，重組蛋白BP26檢測(cè)的陽(yáng)性O(shè)D450平均值與陰性O(shè)D450平均值的比值P/N明顯大于其它4個(gè)重組蛋白的P/N值，確定重組蛋白BP26作為檢測(cè)用抗原。
　　運(yùn)用重組蛋白BP26作為抗原，并對(duì)各反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，初

7、步建立了用于檢測(cè)牛布魯氏菌病血清抗體的間接ELISA方法?？乖罴寻粷舛葹?00 ng/mL，待檢牛血清樣品最佳稀釋度為1∶100，血清樣品的OD450≥0.2×ODP+0.8×ODN判為陽(yáng)性，反之判為陰性(ODP表示陽(yáng)性對(duì)照血清OD450的平均值，ODN陰性對(duì)照血清OD450的平均值)。用建立的間接ELISA方法分別檢測(cè)牛結(jié)核陽(yáng)性血清、牛大腸桿菌陽(yáng)性血清、?？谔阋哧?yáng)性血清和牛病毒性腹瀉陽(yáng)性血清，結(jié)果均為陰性，說(shuō)明該方法具有高度的特異

8、性。取8份OD值不同的血清樣品，分別進(jìn)行8次批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)和2次批間重復(fù)性試驗(yàn)，重復(fù)性良好。
　　用該方法對(duì)174份臨床牛血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，并與IDEXX公司的牛布魯氏菌病Pourquier(@) ELISA試劑盒平行檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，Pourquier(@) ELISA試劑盒陽(yáng)性檢出率為70.11％，本實(shí)驗(yàn)建立的間接ELISA的陽(yáng)性檢出率為68.97％。該方法敏感性、特異性、符合率分別為94.2％(113/120)、83.3％(