牛布魯氏菌Omp25基因的克隆與原核表達及抗原特異性研究.pdf

1、布魯菌(Brucella)是革蘭氏陰性兼性的細胞內(nèi)寄生菌，是一種由布魯菌引起的人畜共患傳染病,給畜牧業(yè)的發(fā)展和人類的健康造成極大的危害。準確的診斷對有效控制和消滅布魯菌病是相當重要的，探索尋找合適的布魯菌診斷性抗原一直是人們的目標，所以具有免疫原性和抗原保護作用的布魯菌外膜蛋白就成為了研究的熱點。
　　本試驗從GeneBank中下載編碼布魯菌外膜蛋白的基因，分析選取目前所有布魯菌基因序列同源性高的基因進行研究。通過分析選取了牛布魯

2、氏菌A544的Omp25基因?qū)ζ溥M行初步研究，利用PCR方法從流產(chǎn)布魯菌基因組DNA中擴增出外膜蛋白基因Omp25，大約642bp的基因片段，將目的基因片段用限制性內(nèi)切酶EcoR I、Xho I雙酶切后直接與經(jīng)雙酶切的表達載pGEX-6p-1連接，將該片段克隆于原核表達載體pGEX-6p-1中，之后將重組表達載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21。重組載體的菌液經(jīng)PCR鑒定、重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定和測序鑒定證明，成功擴增出了目的基因，并且將其成功重組

3、到了表達載體pGEX-6p-1中，重組菌在0.5 mmol/L的IPTG條件下誘導(dǎo)4 h時目的蛋白表達量達到了高峰。表達融合蛋白質(zhì)分子量約為49kDa，以包涵體形式存在。
　　提取包涵體后用電洗脫方法純化融合蛋白，經(jīng)western-blotting分析重組表達融合蛋白Omp25的反應(yīng)原性，發(fā)現(xiàn)該蛋白與弗氏佐劑乳化后免疫家兔得到了較高效價的抗血清。進而用B.suis S2作為菌體抗原包被,用所制的血清作為一抗，羊抗兔IgG為二抗。進