蘋果莖痘病毒的鑒定及其外殼蛋白基因的原核表達(dá).pdf

1、蘋果莖痘病毒(Applestempittingvirus，ASPV)是蘋果和梨樹上普遍發(fā)生的一種潛隱性病毒，廣泛分布于世界各蘋果和梨種植區(qū)。在砧木感病時(shí)該病毒可引起樹體的嚴(yán)重衰退，對(duì)果樹生長(zhǎng)、產(chǎn)量和果品質(zhì)量等造成嚴(yán)重的影響。栽培無病毒種苗是解決蘋果和梨上ASPV危害的有效途徑，病毒檢測(cè)是培育和繁殖無病毒苗木的重要環(huán)節(jié)。 本研究采用生物學(xué)、分子生物學(xué)等方法對(duì)來源于砂梨(Pyruspyrifolia)的P-HH和P-3-2-67及來

2、源于葡萄的G-L3共3個(gè)樣品進(jìn)行了ASPV檢測(cè)和鑒定。通過采用汁液摩擦接種的方法從葡萄上分離獲得分離株G-L3，經(jīng)生物學(xué)表現(xiàn)分析、病毒粒子形態(tài)電鏡觀察以及序列比較分析，確定來源于葡萄的分離物為ASPV。構(gòu)建了來源于砂梨的ASPV的外殼蛋白(Coatprotein，CP)基因原核表達(dá)載體，并成功誘導(dǎo)表達(dá)，制備了表達(dá)蛋白的特異性抗體。具體研究結(jié)果如下： 1.通過汁液摩擦接種草本指示植物西方煙(Nicotianaoccidentali

3、s‘37B’)后，癥狀觀察，兩個(gè)來源于砂梨的分離物(P-HH、P-3-2-67)和一個(gè)來源于葡萄的分離物(G-L3)均顯癥明顯：P-HH在接種葉片上表現(xiàn)凹陷壞死白斑，葉脈壞死，皺縮癥狀；P-3-2-67出現(xiàn)黑色斑點(diǎn)、葉脈壞死和支脈黃化；G-L3出現(xiàn)葉片褪綠斑點(diǎn)、黑色斑點(diǎn)和壞死癥狀。通過試管捕捉反轉(zhuǎn)錄PCR(Tubecapture-reversetranscriptionPCR，TC-RT-PCR)對(duì)3個(gè)分離物進(jìn)行擴(kuò)增后，PCR產(chǎn)物經(jīng)6％

4、PAGE電泳后，3個(gè)分離物均在316bp處出現(xiàn)特異性條帶。進(jìn)一步提純病毒和電鏡觀察，結(jié)果顯示3個(gè)分離物的病毒粒子形態(tài)一致，均為彎曲的長(zhǎng)線形病毒。由此，推測(cè)上述3個(gè)來源于砂梨和葡萄的分離物(P-HH、P-3-2-67和G-L3)均為ASPV。 2.以P-HH、P-3-2-67和G-L3接種表現(xiàn)癥狀的西方煙為材料，通過TC-RT-PCR，對(duì)這3個(gè)分離物CP基因的部分序列(316bp)進(jìn)行了擴(kuò)增、克隆與序列測(cè)定。經(jīng)序列分析，3個(gè)分離物

5、的擴(kuò)增片段與本實(shí)驗(yàn)室前期從砂梨(Pyruspyrifolia)獲得的分離株P(guān)I同源性最高達(dá)98.4％，與國(guó)外報(bào)道的來自于雜種楹槨(Pyroniaveitchii)上的分離株Quince同源性達(dá)93％，與來自于楹槨(Cydoniaoblonga)的分離物N1最低為77.8％。3個(gè)分離物間的核苷酸序列也有一定差異，P-HH/P-3-2-67為99.1％、P-HH/G-L3為99.1％、G-L3/P-3-2.67為99.4％。由此，進(jìn)一步判斷

6、來自于葡萄的分離物G-L3為ASPV，這是ASPV侵染葡萄首次發(fā)現(xiàn)。 3.采用本實(shí)驗(yàn)室前期克隆獲得的來源于梨樹的ASPV分離物6-1-13的CP基因，根據(jù)其序列特征設(shè)計(jì)引物，并在兩端加酶切位點(diǎn)，對(duì)該基因進(jìn)行擴(kuò)增、序列驗(yàn)證后，與載體pET-28a(+)連接構(gòu)建了該基因的原核表達(dá)載體(pET-ASPV-CP)，在大腸桿菌(Escherichiacoli)BL21(DE3)中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)、表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳和West