蘋果莖溝病毒cp基因hpRNA表達(dá)載體的構(gòu)建及其轉(zhuǎn)化煙草研究.pdf

1、病原獲得抗性是植物抗病毒基因工程的一個(gè)重要策略，即將病毒自身的基因?qū)胫参锖?，可使該植物?duì)同種及親緣關(guān)系較近的病毒產(chǎn)生抗性，在該策略中應(yīng)用最早的基因是來自病毒的外殼蛋白基因。大量的研究表明，導(dǎo)入植物的基因轉(zhuǎn)錄物可與入侵的病毒RNA之間相互作用，干擾病毒的侵染或復(fù)制，這種抗性主要是基于轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post-transcriptionalgenesilencing，PTGS)作用。 蘋果莖溝病毒(Applestemgroovin

2、gvirus，ASGV)在蘋果和梨樹上發(fā)生極其普遍的一種+ssRNA病毒，在果樹上多表現(xiàn)為潛伏侵染，但可導(dǎo)致樹勢(shì)的降低和影響果品質(zhì)量。同時(shí)，該病毒可通過汁液摩擦接種傳染至多種草本植物，接種草本寄主植物是研究該病毒生物學(xué)特性的常用途徑之一。 本研究基于dsRNA在RNA沉默中的誘導(dǎo)作用，構(gòu)建ASGV外殼蛋白基因片段的轉(zhuǎn)錄后可形成發(fā)夾狀RNA(hpRNA)的載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化該病毒的草本寄主植物本氏煙，以期為進(jìn)一步研究hpRN

3、A誘導(dǎo)對(duì)同源病毒和異源病毒的抗性及其RNAi特性奠定基礎(chǔ)。 (1)根據(jù)ASGV的CP基因序列特點(diǎn)，設(shè)計(jì)合成了可擴(kuò)增該基因近3'端和5'端大小分別為209bp和392bp的兩對(duì)引物，并在各引物5'端引入兩個(gè)酶切位點(diǎn)。以本實(shí)驗(yàn)室保存的一個(gè)ASGV分離物CP基因克隆的質(zhì)粒為模板，用所合成兩對(duì)引物分別擴(kuò)增獲得長(zhǎng)度為392bp和209bp的特異片段。通過回收、連接、轉(zhuǎn)化E.coliDH10B和酶切鑒定，對(duì)所獲擴(kuò)增片段進(jìn)行了克隆。

4、(2)采用所設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的兩對(duì)限制性內(nèi)切酶對(duì)含有392bp克隆片段的質(zhì)粒分別進(jìn)行雙酶切，回收目標(biāo)片段后與相同雙酶切的表達(dá)載體pASDS714進(jìn)行連接和轉(zhuǎn)化大腸桿菌，獲得含有392bp片段的正向和反向插入片段的重組質(zhì)粒pASDS714-392(+)和pASDS714-392(-)然后對(duì)獲得的pASDS714-392(+)采用另一對(duì)酶進(jìn)行雙酶切后與同對(duì)酶雙酶切獲得的392bp片段連接，獲得在內(nèi)含子兩端分別含有正向插入和反向插入片段的可表

5、達(dá)hpRNA的重組質(zhì)粒pASDS714-392(hp)。 (3)采用同樣的方法，構(gòu)建了ASGVCP基因3'端大小為209bp片段的正向插入和反向插入的重組質(zhì)粒pASDS714-209(+)和pASDS714-209(-)。 (4)將以上所獲含392bp反向插入片段和可表達(dá)392bp片段的hpRNA的重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌EHA105后，采用農(nóng)桿菌侵染法轉(zhuǎn)化本氏煙(Nicotianabenthamiana)葉盤，經(jīng)共培