蘋果莖溝病毒和褪綠葉斑病毒分子變異研究.pdf

1、蘋果莖溝病毒(Applestemgroovingvirus，ASGV)和蘋果褪綠葉斑病毒(Applecholortoticleafspotvirus，ACLSV)是危害梨和蘋果及其它一些果樹的重要病毒，對果樹的生長、產(chǎn)量、果品質(zhì)量等造成嚴重的影響。本研究以ASGV和ACLSV為對象研究其生物學(xué)、血清學(xué)特性和分子變異。目的就是要通過對不同來源分離物的分子變異與生物學(xué)和血清學(xué)特性的比較分析，從分子水平上探索ASGV和ACLSV生物學(xué)多樣性和

2、血清學(xué)差異與分子變異的關(guān)系，結(jié)果如下： 1.通過昆諾藜(Chenopodium.quinoa)接種鑒定和ELISA檢測，從梨和蘋果上獲得ASGV23個分離物。采用TC-RT-PCR對這些分離物進行擴增，均獲得特異的擴增片段，PCR產(chǎn)物經(jīng)5％PAGE電泳，出現(xiàn)大小約500、530和600bp的三種遷移率不同的泳動帶型。根據(jù)PCR產(chǎn)物電泳遷移率的差異，選取3個來源于梨的分離物P-L4、P-6-1-17和P-3-2-67的PCR產(chǎn)物進

3、行克隆與序列測定。經(jīng)BLAST搜索，三個分離物的擴增片段與蘋果分離物P-209的CP基因3′端核苷酸序列同源性分別為92.2％、90.4％和88.4％。3個分離物間的核苷酸序列也有較大差異，P-L4/P-6-1-17為95.5％、P-L4/P-3-2-67為90.4％、P-6-1-17/P-3-2-67為88.6％。 2.選取生物學(xué)和血清學(xué)特性上存在較大差異的ASGV梨分離物P-6-1-17、P-4-1-69、P-L2和P-D-

4、21，采用RT-PCR法對3′端進行擴增，所獲擴增片段經(jīng)序列測定，全長分別為1089nt(P-6-1-17、P-L2)和1069nt(P-4-1-69、P-D-21)。4個分離物的CP基因均由714nt組成，其核苷酸和推導(dǎo)編碼蛋白氨基酸序列同源性分別為89.8％～96.4％和94.9％～97.9％。將我國4個分離物的CP基因與已報道ASGV分離物及分子變種進行序列同源性比較和系統(tǒng)進化樹分析，結(jié)果表明我國ASGV分離物至少可分為2個組群，

5、其中生物學(xué)表現(xiàn)明顯不同于其它分離物的P-L2，其CP基因核苷酸序列顯示較大的變異。 3.通過昆諾藜接種鑒定和ELISA檢測，從梨、蘋果和桃上獲得ACLSV13個分離物。用PAS-ELISA和DAS-ELISA對這13個分離物進行檢測，結(jié)果PAS-ELISA只檢出來源于桃的HBP分離物，而DAS-ELISA檢出來源于桃的HBP、PE-T-5和PE-53個分離物。然而采用RT-PCR和TC-RT-PCR對這些分離物進行擴增，均能獲得

6、特異的358bp目標片段。 4.在昆諾藜和莧色藜上均產(chǎn)生系統(tǒng)褪綠癥狀，且血清學(xué)上相關(guān)的來源于桃和蘋果的HBP、ACLSV-C2個分離物，通過RT-PCR法分別獲得約1.8kb的目標片段。所獲擴增片段經(jīng)序列測定，全長分別為1768nt(GenBank登錄號AY728180)和1751nt。2個分離物的CP基因均由582nt組成，其核苷酸和推導(dǎo)編碼氨基酸序列同源性分別為87.8％和95.9％。將這2個分離物的CP基因與已報道ACLS

7、V分離物進行序列同源性比較和系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果表明，HBP與從蘋果和櫻桃上分離的ACLSV分離物制備的單克隆和多克隆抗體無血清學(xué)關(guān)系(或很弱)的來源于法國李的SX/2的同源性很高，且親緣關(guān)系很近在進化樹中歸為一組。 5.來源于梨的ACLSVP-4-1-69分離物，通過RT-PCR擴增，經(jīng)克隆、序列測定，獲得485nt3′端CP基因序列。P-4-1-69、HBP和ACLSV-C3個分離物間的核苷酸和編碼蛋白氨基酸序列同源性分別為8