粘毛黃芩F3H基因表達載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化煙草研究.pdf

1、粘毛黃芩(Scutellaria viscidula Bge.)為唇形科黃芩屬植物，具有抗炎、抗癌、抗氧化等多種生物活性。其藥理作用有效成分主要是黃酮類化合物，其臨床需求量增加迅速，而粘毛黃芩野生資源破壞嚴重，野生資源面臨枯竭，無法滿足人們的需要。黃烷酮3-羥化酶(flavanone3-hydroxylase，F(xiàn)3H)基因是整個黃酮類化合物代謝途徑的中樞位點，調(diào)控著合成途徑中的代謝流向。它催化柚皮素生成二氫黃酮醇(DHK)，而DHK是黃

2、酮類化合物生物合成中生成黃酮、花色素和異黃酮等黃酮類化合物的重要中間產(chǎn)物。
　　 為了研究粘毛黃芩黃酮化合物生物合成途徑，進而為提高粘毛黃芩體內(nèi)的黃芩苷含量奠定基礎。本研究采用基因超表達和反義抑制研究粘毛黃芩F3H基因的功能，構(gòu)建了F3H基因超表達和反義植物載體，轉(zhuǎn)化煙草植株，并測定了總黃酮含量，獲得的主要結(jié)果如下：1、F3H基因原核表達載體的構(gòu)建
　　 用RT-PCR擴增目的基因Svf3h連接pMD19-T克隆載體，測

3、序正確后，雙酶切含目的基因的克隆載體pMD19-Svf3h和表達載體質(zhì)粒pQE30，將目的片段Svf3h與載體pQE30酶切大片段連接，構(gòu)建成原核表達載體pQE30-Svf3h轉(zhuǎn)化原核表達菌M15，經(jīng)檢測驗證，得到原核表達菌M15-pQE30-Svf3h。2、F3H基因正、反義植物表達載體的構(gòu)建及農(nóng)桿菌菌株的轉(zhuǎn)化
　　 酶切植物克隆表達載體pCXSN質(zhì)粒，RT-PCR擴增目的基因Svf3h，回收目的片段與載體，構(gòu)建成Svf3h的

4、正、反義植物表達載體，結(jié)果構(gòu)建了1種正義pCXSN-Svf3h，2種反義表達載體pCXSN-antiSvf3h，將驗證正確的植物表達載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105，得到EHA105-Svf3h/anti Svf3h農(nóng)桿菌工程菌。3、根癌農(nóng)桿菌介導的F3H基因?qū)煵莸倪z傳轉(zhuǎn)化及PCR鑒定
　　 觀察轉(zhuǎn)化的煙草再生過程發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化F3H基因的煙草植株與未轉(zhuǎn)化煙草植株，在形態(tài)上并無明顯的差異。根據(jù)己知粘毛黃芩F3H基因、潮霉素基因序列設計特異

5、引物，對轉(zhuǎn)化的煙草植株進行PCR檢測。PCR分析顯示，正、反義Svf3h均被整合到煙草基因組中，篩選得到8株陽性反義煙草植株，6株陽性正義煙草植株。4、轉(zhuǎn)SvF3H煙草總黃酮含量的測定
　　 各選5株P(guān)CR檢測結(jié)果陽性轉(zhuǎn)化植株，3株未轉(zhuǎn)化煙草植株作為對照，提取葉片中的總黃酮，用比色法測量其相對含量。結(jié)果表明，正義煙草植株總黃酮的平均含量為2.19％明顯高于反義植株總黃酮類化合物1.39％的含量。陽性正義煙草植株總黃酮的含量與反義