粘毛黃芩CHS基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建及其在煙草中的功能驗(yàn)證.pdf

1、粘毛黃芩(Scutellaria viscidula Bunge)的干燥根是我國常用的中藥材之一，其主要的有效成分黃芩苷為黃酮類化合物。目前市場上的黃芩苷供不應(yīng)求，急需提高它的產(chǎn)量。查爾酮合成酶(chalcone synthase，CHS)是黃酮類化合物生物合成的第一個關(guān)鍵酶，在黃酮類化合物合成代謝中有著極其重要的作用。由于近年來植物基因工程的應(yīng)用蓬勃發(fā)展，因而通過CHS基因工程提高粘毛黃芩中黃芩苷的含量具有重大的實(shí)際意義和廣泛的應(yīng)用前

2、景。
　　 本研究是將粘毛黃芩正反義CHS基因構(gòu)建到植物表達(dá)載體pCAMBIA1304+上，得到CHS基因正反義植物表達(dá)載體，然后通過遺傳轉(zhuǎn)化煙草來驗(yàn)證CHS基因在黃酮類化合物生物合成中的作用。為獲得高產(chǎn)黃芩苷的轉(zhuǎn)CHS基因粘毛黃芩植株奠定基礎(chǔ)。研究內(nèi)容如下：1.CHS基因正反義植物表達(dá)載體的構(gòu)建
　　 PCR擴(kuò)增得到帶酶切位點(diǎn)BlgⅡ和BstEⅡ的正義CHS基因schs和反義CHS基因achs，回收片段與pMD18-T

3、連接，得到正反義克隆載體pMD18-schs和pMD18-achs。用BlgⅡ和BstEⅡ雙酶切pMD18-schs、pMD18-achs質(zhì)粒及表達(dá)載體質(zhì)粒pCAMBIA1304+，膠回收，將正反義CHS基因片段和載體大片段分別進(jìn)行連接，建成正反義中間表達(dá)載體pCAMBIA1304+-schs和pCAMBIA1304+-achs。采用凍融法將pCAMBIA1304+-schs和pCAMBIA1304+-achs分別導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA440

4、4。2.農(nóng)桿菌LBA4404介導(dǎo)的CHS基因轉(zhuǎn)化煙草及分子檢測
　　 取煙草幼嫩無菌葉片，剪成約0.5 cm×0.5cm的小方塊，放入制備好的LBA4404菌液中，浸泡5～8 min。用無菌濾紙上吸干多余菌液，放在共培養(yǎng)基(MS+1.0 mg/L6-BA+0.1 mg/LNAA)上暗培養(yǎng)48 h。然后轉(zhuǎn)到選擇生芽培養(yǎng)基(MS+1.0mg/L6-BA+0.1 mg/LNAA+50mg/LHyg+300 mg/L Cef)上進(jìn)行脫菌

5、選擇培養(yǎng)，經(jīng)過20 d左右的光照培養(yǎng)，葉片開始分化出抗性芽。待不定芽長到2～3 cm，將其切下放到選擇生根培養(yǎng)基(MS+0.1 mg/L NAA+25 mg/L Hyg+300 mg/LCef)上進(jìn)行進(jìn)一步的抗性篩選和生根培養(yǎng)，7天后開始長出不定根。再過二至三周，煙草根系發(fā)達(dá)，成苗。結(jié)果獲得轉(zhuǎn)化煙草41株，其中轉(zhuǎn)pCAMBIA1304+-schs(正義)煙草20株，轉(zhuǎn)pCAMBIA1304+-achs(反義)煙草13株，轉(zhuǎn)pCAMBIA

6、1304+(空載體)煙草8株。
　　 在轉(zhuǎn)基因煙草植株有3～4片葉時，進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色，檢測結(jié)果為陽性的植株移栽至溫室。對GUS檢測為陽性且生長較好的轉(zhuǎn)基因煙草植株進(jìn)行PCR檢測，得到5株陽性正義轉(zhuǎn)基因植株，6株陽性反義轉(zhuǎn)基因植株，3株陽性轉(zhuǎn)空載體植株。選取PCR檢測為陽性且長勢較一致的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行RT-PCR檢測，與對照(未轉(zhuǎn)化的野生型植株WT和轉(zhuǎn)空載體植株P(guān)3)相比，正義轉(zhuǎn)基因植株CS3、CS4和CS6的cDNA都能

7、擴(kuò)增出1170 bp大小的目的片段ochs，而反義轉(zhuǎn)基因植株CA2、CA4和CA6的cDNA均完全不能擴(kuò)增出目的片段ochs。說明外源正義CHS基因schs在正義轉(zhuǎn)基因植株中已轉(zhuǎn)錄為mRNA，使煙草中CHS基因超量表達(dá)；而整合到反義轉(zhuǎn)基因煙草基因組的反義CHS基因achs，抑制了煙草CHS基因的表達(dá)。3.轉(zhuǎn)基因煙草總黃酮和蘆丁含量的測定
　　 以分子檢測為陽性的轉(zhuǎn)基因煙草和未轉(zhuǎn)化的野生型煙草(對照)為材料，用紫外分光光度法測定其

8、總黃酮含量，HPLC法測定其蘆丁含量。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)空載體植株與對照的總黃酮和蘆丁含量均相近；正義轉(zhuǎn)基因植株中總黃酮含量都高于對照植株，其中CS4的總黃酮含量最高，比對照提高了4 mg/g DW左右，與對照相比，CS4的蘆丁含量也顯著增加；反義轉(zhuǎn)基因植株的總黃酮含量均低于對照植株，其中CA2的總黃酮含量最低，比對照降低了約6 mg/gDW，與對照相比，CA2中的蘆丁含量也明顯降低。說明，CHS基因的表達(dá)量直接影響黃酮類化合物的合成量，它是