桑樹F3H、ANR及FLS基因克隆及其在不同桑種質(zhì)間的表達(dá)差異.pdf

1、桑樹作為一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，已經(jīng)有幾千年的種植歷史，不僅可以作為家蠶的飼料，還具有重要的藥用價(jià)值。黃酮類化合物是植物體內(nèi)重要的次生代謝產(chǎn)物之一，而花青素是其中一種重要的分支產(chǎn)物，具有重要的開發(fā)利用價(jià)值。本課題組前期對(duì)桑樹黃酮類化合物的含量、成分分離純化以及調(diào)控其生物合成的部分基因進(jìn)行了研究，克隆出黃酮類生物合成的4個(gè)關(guān)鍵基因 PAL、C4H、4CL與CHS全長(zhǎng)。本研究以桑樹為材料，克隆了由苯丙氨酸途徑轉(zhuǎn)向花青素合成途徑中三個(gè)基因F3H、

2、ANR和FLS的cDNA全長(zhǎng)序列。利用熒光定量PCR技術(shù)分析了以上三個(gè)基因在不同種質(zhì)葉片中的表達(dá)情況，并與總黃酮和總花青素含量進(jìn)行了比較分析。本研究對(duì)培育富含黃酮類化合物的桑樹種質(zhì)材料提供參考依據(jù)。主要研究結(jié)果如下：
　　1、桑樹黃烷酮3-羥化酶基因（F3H）的克隆及序列分析
　　黃烷酮3-羥化酶（F3H）是控制花青素和其他黃酮類化合物合成的分支點(diǎn)，影響不同種類黃酮類化合物的合成。通過 RT-PCR和 RACE技術(shù)，以桑樹幼

3、葉cDNA為模板，克隆了F3H基因全長(zhǎng)序列，命名為MmF3H（GenBank登錄號(hào)：KU301748）。該基因cDNA全長(zhǎng)為1376bp，其中編碼區(qū)為1095bp，編碼365個(gè)氨基酸，還包含130bp的5?端和151bp的3?端非編碼區(qū)。預(yù)測(cè)其編碼蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)為4.93，分子量為113.728kD，與NCBI中其他6種F3H進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)，結(jié)果顯示有較高的同源性（79％以上）。
　　2、桑樹花青素還原酶基因（ANR）的克隆及

4、序列分析
　　花青素還原酶（ANR）催化由花色素生成反式黃烷-3-醇的反應(yīng)。通過RT-PCR和RACE技術(shù)，以桑樹幼葉cDNA為模板，克隆到ANR基因全長(zhǎng)的克隆，命名為MmANR（GenBank登錄號(hào)：KU507307）。該基因cDNA全長(zhǎng)為1129bp，其中編碼區(qū)為1011bp，編碼337個(gè)氨基酸，還包含115bp的5?端非編碼區(qū)和一個(gè)終止密碼子。預(yù)測(cè)該基因編碼蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)為6.51，分子量為36.612kD，與NCBI中其他

5、6種ANR進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)，結(jié)果顯示有較高的同源性（77%以上）。
　　3、桑樹黃酮醇合成酶基因（FLS）的克隆及序列分析
　　黃酮醇合成酶（FLS）催化由二氫黃酮醇合成黃酮醇的反應(yīng)。通過 RT-PCR和RACE技術(shù)，以桑樹幼的cDNA為模板，克隆了FLS基因全長(zhǎng)，命名為MmFLS（GenBank登錄號(hào)：KU507308）。該基因cDNA全長(zhǎng)為1074bp，其中編碼區(qū)為1005bp，編碼335個(gè)氨基酸，還包含66bp的5?

6、端非編碼區(qū)和一個(gè)終止密碼子。預(yù)測(cè)該基因編碼蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)為5.55，分子量為37.981kD，與NCBI中其他6種FLS進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)，結(jié)果顯示有較高的同源性（68%以上）。
　　4、F3H、ANR、FLS在不同種質(zhì)間的表達(dá)差異分析
　　三個(gè)基因熒光定量 PCR分析及桑葉總黃酮和總花青素含量測(cè)定結(jié)果表明，F(xiàn)3H、ANR和FLS在不同桑樹種質(zhì)間表達(dá)水平差異顯著；F3H基因表達(dá)水平與總黃酮含量有一定的相關(guān)性，與花青素含量相關(guān)