蕪菁花青素合成關(guān)鍵基因F3H啟動(dòng)子區(qū)序列及藍(lán)光受體CRY1基因的克隆與初步功能分析.pdf

1、依賴于藍(lán)光的花青素合成現(xiàn)象是植物中普遍存在的一種現(xiàn)象，近期研究表明這種現(xiàn)象是由植物藍(lán)光受體—隱花色素（Cryptochrome，CRY）所介導(dǎo)的。本研究對(duì)克隆花青素合成依光型蕪菁品種“津田”蕪菁中的花青素合成關(guān)鍵基因F3H(flavanone3-hydroxylase)的啟動(dòng)子區(qū)序列以及藍(lán)光受體CRY1基因進(jìn)行了克隆和功能分析，為揭示植物隱花色素對(duì)花青素合成的調(diào)節(jié)機(jī)制開展了必要的前期工作。1F3H啟動(dòng)子區(qū)序列的克隆、分析與瞬時(shí)表達(dá)。

2、r>　　根據(jù)已經(jīng)公布的Brassica rapa subsp.pekinensis中含有F3H基因的KBrS001M03克隆序列，采用常規(guī)PCR的方法，克隆得到“津田”蕪菁F3H基因啟動(dòng)子區(qū)序列。在線比對(duì)和生物信息學(xué)分析表明此序列是位于“津田”蕪菁F3H基因上游的啟動(dòng)子區(qū)序列，具有啟動(dòng)子特征。利用plantcare工具分析統(tǒng)計(jì)此序列中的各個(gè)功能元件，發(fā)現(xiàn)其中除具有一般真核生物啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)所普遍具有的保守CAAT box和TATA box等

3、序列外，還有許多其他的保守序列。
　　采用研究啟動(dòng)子的pKGWFS7載體，利用Gateway技術(shù)將此序列替換到Gus基因的上游，驅(qū)動(dòng)Gus基因在“津田”蕪菁無菌苗的離體胚軸和子葉中瞬時(shí)表達(dá)。檢測(cè)結(jié)果顯示，胚軸和子葉中均有Gus基因表達(dá)。而且無論是在光下還是在黑暗中，克隆到的F3H啟動(dòng)子區(qū)序列均可驅(qū)動(dòng)Gus基因正常表達(dá)。可見所克隆的序列具有啟動(dòng)子功能。
　　2蕪菁CRY1基因的克隆與功能初步分析
　　1) CRY1基因的

4、克隆及其功能分析
　　采用RT-PCR的方法克隆蕪菁的CRY1基因，對(duì)克隆得到序列進(jìn)行和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，初步確定其為CRY1基因。研究了此基因在不同波長(zhǎng)光下的表達(dá)情況，結(jié)果表明蕪菁CRY1基因的表達(dá)量基本一致，為組成型表達(dá)。這說明CRY1與其他因子發(fā)生作用來傳遞光信號(hào)影響花青素的合成。利用酵母雙雜交系統(tǒng)研究蕪菁CRY1與COP1的相互作用的結(jié)果表明兩者之間具有相互作用，表明其具有與擬南芥中藍(lán)光受體傳遞光信號(hào)的類似機(jī)制。
　　

5、2) CRY1-dsRNAi表達(dá)載體的構(gòu)建與遺傳轉(zhuǎn)化
　　為更深入的研究蕪菁CRY1的生理功能，采用Gateway克隆系統(tǒng)，根據(jù)克隆到的“津田”蕪菁CRY1基因序列設(shè)計(jì)RNA干涉引物，成功構(gòu)建了蕪菁CRY1雙鏈RNA干擾表達(dá)載體:CRY1-dsRNAi。
　　采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化蕪菁，對(duì)影響蕪菁離體再生和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化的各個(gè)因素進(jìn)行了研究。通過對(duì)外植體類型、激素種類、AgNO3濃度、無菌苗苗齡、預(yù)培養(yǎng)時(shí)間等因素的優(yōu)

6、化，獲得了再生頻率達(dá)90％左右的離體再生體系，可以滿足遺傳轉(zhuǎn)化的要求。研究發(fā)現(xiàn)，采用TDZ代替前人常采用的BA來與NAA配合更適于“津田”蕪菁的離體再生，適合再生的激素組合為TDZ7.0 mg/L+NAA1.0 mg/L。5.0 mg/L AgNO3對(duì)再生來講是必須的。外植體以苗齡為5d的帶柄子葉為好。采用含1.0 mg/L的2，4-D的MS培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)2d可以一定程度上提高再生的頻率。
　　在已經(jīng)建立的蕪菁離體再生體系的基礎(chǔ)上，