天山雪蓮花青素生物合成關(guān)鍵酶基因的克隆及功能鑒定.pdf

1、天山雪蓮(Saussurea involucrate Kar.et Kir.)為新疆特有的珍稀植物,特殊的生長環(huán)境造就了其獨(dú)特的藥用價值。天山雪蓮花青素為黃酮類物質(zhì),是其重要的藥效成分之一,有限的雪蓮資源無法滿足市場需求。因此利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù),從天山雪蓮中分離克隆花青素生物合成相關(guān)基因,運(yùn)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法將與花青素合成相關(guān)的DFR和3GT基因轉(zhuǎn)化進(jìn)入天山雪蓮愈傷組織內(nèi),通過離體細(xì)胞懸浮培養(yǎng)獲得高產(chǎn)黃酮的天山雪蓮細(xì)胞系,來保

2、障新疆瀕危物種資源的可持續(xù)開發(fā)利用,對天山雪蓮花青素新產(chǎn)品的開發(fā)具有重要的應(yīng)用價值。主要研究結(jié)果如下:
　　1.天山雪蓮花青素生物合成關(guān)鍵酶基因的克隆與序列分析
　　二氫黃酮醇4-還原酶(DFR)和UDP葡萄糖-類黃酮-3-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(3GT)是植物重要的次生代謝產(chǎn)物花青素生物合成途徑中的關(guān)鍵酶。運(yùn)用RT-PCR和RACE技術(shù)從天山雪蓮中克隆得到DFR基因(GenBank登錄號為JN092126)和3GT基因(Gen

3、Bank登錄號為JN092127)。DFR基因的cDNA全長序列含有1個1029 bp的開放閱讀框(ORF),編碼343個氨基酸,該基因水母雪蓮DFR基因高度同源,相似性達(dá)到97％;3GT基因的cDNA全長序列含有1個1548 bp的開放閱讀框(ORF),編碼516個氨基酸,該基因推斷的蛋白序列與草莓GT6蛋白序列的相似性為91％,與毛楊梅3GT的相似性為89％;半定量PCR的結(jié)果顯示,天山雪蓮DFR基因和3GT基因在葉及愈傷組織中表達(dá)

4、量最高,在根中有少量表達(dá),莖中不表達(dá)。
　　2.天山雪蓮遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立
　　通過研究不同濃度的卡那霉素(kan)、潮霉素(hyg)、羧芐青霉素(car)對天山雪蓮愈傷組織誘導(dǎo)、生長及分化的影響,以確定在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化中篩選劑和抑菌劑的最適濃度。結(jié)果表明:40 mg/L的卡那霉素已經(jīng)表現(xiàn)出對天山雪蓮愈傷組織生長的抑制,當(dāng)卡那霉素為50 mg/L時,愈傷組織的生長基本停止;8.0 mg/L的潮霉素能夠有效抑制天山雪蓮愈

5、傷組織的生長,當(dāng)潮霉素濃度為20 mg/L時表現(xiàn)為生長的愈傷組織塊較小、褐化、甚至死亡。同時,低濃度(0.5-2.0 mg/L)的潮霉素可以提高雪蓮愈傷組織的分化率;羧芐青霉素作為農(nóng)桿菌抑菌劑,不同濃度的羧芐霉素對雪蓮愈傷組織生長的影響差異極顯著,當(dāng)羧芐霉素的濃度超過400 mg/L時對雪蓮愈傷組織的出愈及生長均有明顯的抑制作用。分別構(gòu)建了含有CaMV35S啟動子的雪蓮DFR基因和3GT基因的植物表達(dá)載體pMON530-DFR和pCAM

6、BIA1305.1-3GT。經(jīng)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)分析得出10 min為最佳的轉(zhuǎn)化時間,當(dāng)菌液濃度比值為1:1時對愈傷組織出愈及生長的影響最小。
　　3.天山雪蓮DFR基因及3GT基因的遺傳轉(zhuǎn)化
　　通過農(nóng)桿菌葉盤轉(zhuǎn)化法,將天山雪蓮DFR基因和3GT基因分別及共同轉(zhuǎn)化進(jìn)入天山雪蓮愈傷組織中,經(jīng)卡那霉素和潮霉素的篩選,獲得了抗性愈傷組織。經(jīng)PCR檢測單轉(zhuǎn)DFR基因的轉(zhuǎn)化率為12.67％,單轉(zhuǎn)3GT基因的轉(zhuǎn)化率為9.33％,共轉(zhuǎn)以上兩