中生菌素生物合成基因zpsA的克隆及功能鑒定.pdf

1、中生菌素(Zhongshengmycin)是由淡紫灰鏈霉菌海南變種(Streptomyceslavendulaevar.hainanensis)合成的N-糖苷類農(nóng)用抗生素，對(duì)農(nóng)作物細(xì)菌性病害和真菌性病害具有良好的防治效果?！　”狙芯吭谕惪股?諾爾絲菌素、鏈絲菌素)生物合成相關(guān)基因序列已知的基礎(chǔ)上，利用PCR的方法對(duì)淡紫灰鏈霉菌海南變種的中生菌素生物合成酶(β-賴氨酸活化酶)基因進(jìn)行克隆和序列分析，并最終對(duì)其功能進(jìn)行鑒定。　　根據(jù)

2、非核糖體肽合成酶A域(腺苷酸化域)氨基酸序列中存在的十個(gè)保守區(qū)，并根據(jù)已知的諾爾絲菌素肽合成酶基因(npsA)序列和鏈絲菌素肽合成酶基因(sttA)序列設(shè)計(jì)出多條PCR引物，以UV-69菌株的總DNA為模板，先后擴(kuò)增出四段長度分別為284bp、611bp、370bp和350bp的基因序列，經(jīng)過拼接最終得到1.025kb的中生菌素肽合成酶的基因(zpsA)序列。在GeneBank中進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明，克隆出的基因與諾爾絲菌素肽合成酶、鏈絲

3、菌素肽合成酶以及非核糖體肽合成酶的基因序列有著很高的同源性，相應(yīng)基因編碼的蛋白也具有很高的同源性，基因和蛋白的同源性都達(dá)到了75％以上。根據(jù)比對(duì)結(jié)果，推測(cè)zpsA基因編碼的是β-賴氨酸活化酶，與npsA和sttA編碼的蛋白功能相同。具有非核糖體肽合成酶腺苷酸化域的功能(A域)?！　?yīng)用基因單交換插入失活的原理，進(jìn)一步鑒定了zpsA基因的功能。構(gòu)建用于基因破壞的溫度敏感型重組質(zhì)粒pK2(pKC1139：：611bpzpsA)，對(duì)中生菌素

4、產(chǎn)生菌淡紫灰鏈霉菌海南變種UV-69菌株原生質(zhì)體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，39℃培養(yǎng)10天，利用安普霉素抗性篩選，得到了重組的阻斷株。通過PCR的方法初步確定zpsA基因被破壞。將阻斷株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，測(cè)量效價(jià)。結(jié)果表明，阻斷株產(chǎn)素效價(jià)明顯低于出發(fā)菌株UV-69，說明zpsA基因參與了中生菌素的生物合成，編碼中生菌素生物合成過程中的一個(gè)重要酶?！　≡谶M(jìn)行zpsA基因功能鑒定實(shí)驗(yàn)之前，對(duì)UV-69的原生質(zhì)體的再生及轉(zhuǎn)化系統(tǒng)進(jìn)行了優(yōu)化。篩選到的最佳條件為：