磷氮霉素生物合成基因簇的克隆及功能研究.pdf

1、磷氮霉素（PNs，也稱Phoslactomycins，PLMs）是由多種鏈霉菌產(chǎn)生的具有抗真菌、抗腫瘤活性的一類多組分聚酮類化合物，因分子中含有磷酸基和氨基而得名。它們是蛋白磷酸化酶2A（PP2A）的選擇性抑制劑，有發(fā)展成為抗腫瘤藥物先導或農(nóng)用抗真菌生物農(nóng)藥的潛力。然而PNs的哺乳動物毒性限制了其作為農(nóng)藥的應用前景?；诖?，本課題主要目標是克隆PNs生物合成基因簇，通過對PNs生物合成機制研究，闡明其獨特酶催化反應機制，利用代謝工程和生

2、物化學方法改造其化合物結(jié)構(gòu)，獲取PNs的“非天然”的天然產(chǎn)物類似物。希望發(fā)現(xiàn)生物活性保持或提高而毒性降低的PNs類似物，為新型生物農(nóng)藥的發(fā)現(xiàn)與開發(fā)奠定基礎。 依據(jù)文獻報道并優(yōu)化發(fā)酵條件，使PNs的發(fā)酵產(chǎn)量穩(wěn)定在較高水平；在E.coli ET12567和Streptomyces platensis SAM—0654之間建立了有效的接合轉(zhuǎn)移遺傳轉(zhuǎn)移系統(tǒng)；同時采用pCClFos為載體構(gòu)建了高質(zhì)量基因組文庫，效價達8000cfu/μgD

3、NA。 根據(jù)已經(jīng)報道的來源于Streptomyces HK803的PLMs生物合成基因簇同源基因設計簡并引物：以S.platensis SAM—0654基因組DNA為模板，通過PCR擴增克隆得到一高同源性基因片段；以此基因片段標記探針對S.platensisSAM—0654基因組文庫進行原位雜交篩選，并結(jié)合染色體步移技術(shù)得到了與PNs合成相關(guān)的完整生物合成基因簇。 通過測序共獲得約100kb連續(xù)DNA序列，共包含40個開

4、放閱讀框架；推測其中的22個ORF與PNs的生物合成相關(guān)。這22個ORF包含了7個PKS基因，2個負責乙基丙二酰輔酶A合成基因，4負責環(huán)己酰輔酶A合成個基因，一個轉(zhuǎn)運蛋白基因，6個后修飾基因，兩個調(diào)控基因。在生物信息學分析基礎上提出了PNs生物合成途徑，并通過基因中斷證實了該基因簇與PNs的生物合成相關(guān)性。 對比克隆到得S.platensisSAM—0654的PNs生物合成基因簇與文獻報道的S.HK803中PLMs生物合成基因簇

5、發(fā)現(xiàn)宿主菌產(chǎn)生產(chǎn)生同一化合物的生物合成基因具有較高同源性，但二者的前體生物合成基因和調(diào)控基因存在較大差異。借助于PCR—targrting方法致力于兩個前體基因pnP5，pnP6及兩個調(diào)控基因pnR1，pnR2的功能研究。 總之，PNs生物合成基因簇的克隆與功能研究及與PLMs生物合成基因簇對比提示同一化合物在不同宿主菌種可能有完全不同的調(diào)控機制，其進一步深入研究將推動PNs作為生物農(nóng)藥的開發(fā)和發(fā)展。 上述工作為開發(fā)磷氮