鼠李糖脂減毒高產(chǎn)菌株的構(gòu)建和鹽霉素基因簇salBⅢ基因功能研究.pdf

1、鼠李糖脂是一種低毒性，易于生物降解的，具有良好選擇性和專一性的糖脂類陰離子生物表面活性劑，在醫(yī)藥、食品、化妝品、環(huán)境保護(hù)等眾多工業(yè)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。銅綠假單胞菌(Pseudomas aeruginosa)是目前鼠李糖脂產(chǎn)量最高的菌株，但是其具有條件致病性，易感染免疫力低下的患者，臨床感染率可以達(dá)到30％以上，直接用于工業(yè)生產(chǎn)存在很嚴(yán)重的安全隱患。5-烯醇丙酮酞莽草酸-3-磷酸合成酶基因aroA是細(xì)菌和植物莽草酸途徑合成芳香族氨基酸

2、的關(guān)鍵基因，而哺乳動(dòng)物不具備這種途徑。在前期研究中，本課題組利用在假單胞菌中建立的高效同源重組系統(tǒng)，成功敲除了銅綠假單胞菌PAO1(Pseudomas aeruginosa PAO1)的aroA基因，從而構(gòu)建出了一株在添加有芳香族氨基酸的培養(yǎng)基中才能生長(zhǎng)的減毒Pseudomas aeruginosa PAO1-ΔaroA。本課題在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了一個(gè)鼠李糖脂表達(dá)質(zhì)粒，該質(zhì)粒包含鼠李糖脂合成相關(guān)基因鼠李糖脂轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體RhlAB、自轉(zhuǎn)運(yùn)酯酶

3、基因EstA、慶大霉素抗性基因、接合轉(zhuǎn)移起始位點(diǎn)oriT和一個(gè)廣譜性復(fù)制子pBBRI。將該質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化進(jìn)入構(gòu)建好的減毒菌株P(guān)AO1-ΔaroA中，多拷貝質(zhì)粒可以增加鼠李糖脂合成相關(guān)基因在該菌中的拷貝數(shù)，且在發(fā)酵過程中不會(huì)丟失，通過鼠李糖脂甲苯乳化實(shí)驗(yàn)和測(cè)定鼠李糖脂發(fā)酵產(chǎn)量可確定該減毒菌株的鼠李糖脂產(chǎn)量可增加75％。最終，本課題成功構(gòu)建了該高產(chǎn)鼠李糖脂的減毒PAO1-ΔaroA。
　　鹽霉素是由白色鏈霉菌DSM41398產(chǎn)生的一種離子

4、載體抗生素，它能夠妨礙細(xì)胞內(nèi)外Na+/Ca2+的傳遞，破壞膜內(nèi)外離子平衡，造成細(xì)胞死亡，對(duì)革蘭氏陽性菌（包括分枝桿菌和一些絲狀真菌）及各種球蟲有很強(qiáng)的抑制和殺滅作用。最近研究發(fā)現(xiàn)，鹽霉素不僅能夠殺死乳腺癌干細(xì)胞，還能抑制前列腺癌、肝癌和肺癌等多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，具有比普通抗癌藥物紫杉醇更好的藥效。前期研究將鹽霉素合成基因簇克隆至天藍(lán)色鏈霉菌A3(2)中進(jìn)行異源表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)并未表達(dá)出預(yù)期的鹽霉素（m/z=733.6[M-H2O+H]+），而