用BAC介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因鼠研究人α與β珠蛋白基因簇的表達(dá)調(diào)控.pdf

1、人類珠蛋白基因家族分為α和β兩個(gè)基因簇。位于第16號(hào)染色體短臂上的α-珠蛋白基因簇以5'-ζ-ψζ-ψα-α2-α1-θ-3'順序排列，其中ζ為胚胎型功能基因，α為胎兒型和成年型功能基因，全長約40kb；位于第11號(hào)染色體短臂上的β-珠蛋白基因簇以5'-ε-Gγ-Aγ-ψβ-δ-β-3'順序排列，其中ε為胚胎型功能基因，Gγ和Aγ為胎兒型功能基因，β為成年型功能基因，全長約50kb。 珠蛋白基因在個(gè)體發(fā)生中表現(xiàn)為依次表達(dá)，并具

2、有高度的組織特異性和發(fā)育階段特異性；兩類珠蛋白基因的終產(chǎn)物間始終維持平衡。珠蛋白基因的轉(zhuǎn)錄受編碼基因與其旁側(cè)序列甲基化程度、順式作用元件、細(xì)胞內(nèi)反式作用因子和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)控制。β-珠蛋白基因座控制區(qū)(LocusControlRegion，LCR)位于ε-基因上游，由四個(gè)紅系特異性的DNaseⅠ高敏位點(diǎn)(HS)和一個(gè)非紅系特異性的HS(功能有爭議)組成，它們對(duì)于β-珠蛋白基因簇內(nèi)各個(gè)珠蛋白基因在紅系組織細(xì)胞中的高表達(dá)是必需的。α-珠蛋

3、白基因簇上游亦存在類似的一系列高敏位點(diǎn)(PositiveControlElement，PCE)，參與調(diào)控α樣珠蛋白基因的表達(dá)。 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是指以實(shí)驗(yàn)方法導(dǎo)入的外源基因在其染色體基因組中穩(wěn)定整合并能遺傳給后代的一類動(dòng)物。利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究真核基因的表達(dá)調(diào)控可以在分子水平上設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，從四維時(shí)空觀察轉(zhuǎn)基因的整體效應(yīng)。此外，利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)可以建立人類疾病相關(guān)基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型，以探討異?；虻谋磉_(dá)調(diào)控規(guī)律。近年發(fā)展起來的建立在大

4、腸桿菌F因子基礎(chǔ)上的細(xì)菌人工染色體(BacterialArtificialChromosome，BAC)載體，可攜帶長達(dá)300kb以上的外源DNA片段，使人們得以利用包含完整基因簇的大片段DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究，克服以往小片段重組體轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)中忽略基因間或調(diào)控元件之間相互作用的缺陷，從而研究大片段基因簇的表達(dá)調(diào)控規(guī)律。BAC載體的遺傳特性穩(wěn)定，不易發(fā)生缺失和重組；制備和純化方法簡便快速；可直接進(jìn)行DNA測(cè)序分析；載體上的稀有限制性內(nèi)切

5、酶NotI位點(diǎn)可以方便地線性化BACDNA并去除載體片段，具有粘粒(Cosmid)、酵母人工染色體(YeastAritificialChromosome，YAC)等其他大容量載體不可比擬的優(yōu)越性。因此在人類基因組計(jì)劃和基因表達(dá)調(diào)控等研究領(lǐng)域，BAC文庫獲得了廣泛的應(yīng)用。 本研究首先利用溫度敏感型穿梭載體(shuttlevector)介導(dǎo)的同源重組的方法，修飾含全長人β珠蛋白基因簇及一段IL-11受體α鏈基因的BAC克隆，經(jīng)氯霉

6、素(Ch1)正篩選和鐮孢菌酸(FA)負(fù)篩選，獲得發(fā)生兩次同源重組后只含修飾后BACDNA而穿梭載體已丟失的菌株。經(jīng)脈沖場凝膠電泳(PulseFieldGelElectrophoresis，PFGE)鑒定后，大量提取并純化BACDNA后，用NotI酶切分離出包含完整人β-珠蛋白基因簇的插入片段，經(jīng)SepharoseCL-4B柱凝膠過濾層析快速分開了插入DNA片段和載體DNA，選擇合適濃度的DNA經(jīng)顯微注射制作轉(zhuǎn)基因小鼠，并成功地建立了相關(guān)

7、的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。核酸酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)(RNaseProtectionAssay，RPA)結(jié)果顯示含完整人LCR結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)的人β類珠蛋白基因表達(dá)呈現(xiàn)正確的組織特異性和發(fā)育階段特異性，IL-11α鏈?zhǔn)荏w基因的有無并沒有影響轉(zhuǎn)基因鼠體內(nèi)的人β類珠蛋白基因發(fā)育階段特異性表達(dá)。但在HS5缺如的轉(zhuǎn)基因鼠中，人γ-珠蛋白基因不表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)LCR結(jié)構(gòu)的完整性對(duì)β-珠蛋白基因簇的表達(dá)調(diào)控至關(guān)重要。 為探討LCR與PCE對(duì)兩類珠蛋白基因簇表

8、達(dá)調(diào)控模式上的差異，采用改良的ETCloning同源重組技術(shù)，分別修飾BAC186D7及BAC191K2克隆，構(gòu)建含LCR與α結(jié)構(gòu)基因的重組體，獲得9株轉(zhuǎn)基因鼠。收集4株外源基因單拷貝的轉(zhuǎn)基因鼠胚胎組織，檢測(cè)α-類珠蛋白基因的表達(dá)情況。結(jié)果表明：1)人ζ-珠蛋白基因的轉(zhuǎn)錄在胚胎期正常開啟(表達(dá)量8.5天與9.5天最多，以后逐漸減少)，成年期關(guān)閉。2)人α2珠蛋白基因在轉(zhuǎn)基因小鼠的整個(gè)胚胎發(fā)育中持續(xù)表達(dá)，但成年期表達(dá)水平明顯高于胚胎期，這

9、與鼠內(nèi)源α基因表達(dá)模式相似。3)人α1珠蛋白基因僅在12.5天胎肝中才出現(xiàn)表達(dá)，且表達(dá)量較之α2珠蛋白低。4)4個(gè)株系轉(zhuǎn)基因鼠的人α珠蛋白基因表達(dá)水平存在差異，其中有一株不表達(dá)，其余3株分別為鼠內(nèi)源珠蛋白表達(dá)水平的30％-140％，說明外源基因位于染色體的不同整合位點(diǎn)環(huán)境對(duì)其表達(dá)水平有影響，缺乏整合位點(diǎn)不依賴性。 綜上結(jié)果說明：1)利用溫度敏感型的穿梭載體經(jīng)同源重組，成功刪除了位于嵌合體B5-BAC克隆中IL-11受體α鏈基因

10、，建立了相關(guān)的轉(zhuǎn)基因鼠模型。2)IL-11受體α鏈基因的有無并不影響β珠蛋白基因的發(fā)育模式及表達(dá)水平。但LCR中HS5的缺如，使γ珠蛋白基因在胚胎發(fā)育中不表達(dá)。3)利用改良的ETCloning同源重組技術(shù)，構(gòu)建了含LCR與反向α結(jié)構(gòu)基因的重組體，獲得9株轉(zhuǎn)基因鼠。4)上游調(diào)控序列LCR取代PCE后，并沒有影響距離LCR最遠(yuǎn)的人ζ-珠蛋白基因表達(dá)的發(fā)育模式，但較正常α轉(zhuǎn)基因鼠的關(guān)閉時(shí)相提前。說明人ζ-珠蛋白基因?qū)ι嫌握{(diào)控序列的依賴性較小，

11、而受鄰近序列的影響較大，如啟動(dòng)子序列，3'-非翻譯區(qū)序列等，更傾向于自我調(diào)控。人α珠蛋白基因的開關(guān)受到影響，表現(xiàn)在人α2珠蛋白基因在轉(zhuǎn)基因小鼠的整個(gè)胚胎發(fā)育中持續(xù)表達(dá)，但成年期表達(dá)水平明顯高于胚胎期，與鼠內(nèi)源α基因表達(dá)模式相同，然而人α1珠蛋白基因僅在成年期表達(dá)，且表達(dá)量較之α2珠蛋白低。此外，4個(gè)株系轉(zhuǎn)基因鼠的人α-類珠蛋白基因表達(dá)水平存在差異，其中有一株不表達(dá)，說明外源基因位于染色體的不同整合位點(diǎn)環(huán)境對(duì)其表達(dá)水平有影響，缺乏整合位點(diǎn)