人載脂蛋白(a)基因簇增強(qiáng)子體內(nèi)檢測系統(tǒng)構(gòu)建.pdf

1、人載脂蛋白(a)[apolipoprotein (a),apo(a)]基因簇是研究真核基因表達(dá)調(diào)控的良好模型,而且其研究結(jié)果對臨床有指導(dǎo)作用.升高的血漿脂蛋白(a)[lipoprotein (a),lp(a)]水平為動脈粥樣硬化的一個(gè)主要危險(xiǎn)因素,而研究表明它的表達(dá)水平主要由apo(a)的表達(dá)水平?jīng)Q定.基于目前眾多的用于篩選和鑒定DNA調(diào)節(jié)片段的方法,我們采用了重組酶介導(dǎo)的片段交換(recombinase-mediated casset

2、te exchange,RMCE)技術(shù),利用重組酶的位點(diǎn)特異性重組特性,在基因組內(nèi)的特定位點(diǎn)有效地進(jìn)行靶片段與目的片段的交換.經(jīng)典的RMCE過程分為以下三個(gè)步驟(1)靶載體(target vector)隨機(jī)整合在細(xì)胞基因組上,靶片段的兩側(cè)為互為非相容性(mutually incompatible)的兩種Lox序列,它們僅僅間隔區(qū)不同;(2)交換載體(exchange vector)與Cre重組酶表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染基因組內(nèi)整合有靶載體的細(xì)胞株

3、;(3)在重組酶介導(dǎo)下,交換載體上兩種Lox序列間的交換片段與靶載體上的靶片段發(fā)生交換,實(shí)現(xiàn)在基因組的同一位點(diǎn)上交換片段的整合.通過Cre介導(dǎo)的RMCE技術(shù),產(chǎn)生基因組的特定位點(diǎn)(artificial genomic loci,AGL),可以在特定的染色質(zhì)環(huán)境下研究調(diào)控序列的作用機(jī)制,隔離子的功能,染色質(zhì)的位置效應(yīng)以及高效表達(dá)目的蛋白質(zhì)等.該實(shí)驗(yàn)首先設(shè)計(jì)有相應(yīng)酶切位點(diǎn)的引物,從人Apo(a)-Plasminogen基因簇BAC(DH 1

4、0B株)中擴(kuò)增apo(a)啟動子序列,與質(zhì)粒pL1-HYTK-1L-SV40-EGFP-Neo進(jìn)行定向連接,在報(bào)告基因EGFP和Neo的編碼序列上游以313bp apo(a)啟動子的核心序列替換SV40啟動子.在該實(shí)驗(yàn)篩選出的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化HYG<'r>-HepG2細(xì)胞系的基礎(chǔ)上,可以進(jìn)一步構(gòu)建立換載體,行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)化,GCV負(fù)篩選,流式細(xì)胞儀分析,進(jìn)行apo(a)基因簇順式元件(主要為增強(qiáng)子)的篩選和鑒定.同時(shí)這也是構(gòu)建細(xì)胞芯片的基礎(chǔ)步驟:細(xì)

5、胞芯片技術(shù)是新近發(fā)展起來的一種高通量轉(zhuǎn)化技術(shù),利用反向轉(zhuǎn)化的原理,在芯片上點(diǎn)樣(載有交換片段的交換載體DNA)后,將細(xì)胞培養(yǎng)在芯片上攝入外源DNA,在芯片的原位檢測轉(zhuǎn)化信號,進(jìn)行大規(guī)模的轉(zhuǎn)化分析,從而進(jìn)行高通量的順式元件的功能分析.該實(shí)驗(yàn)在HepG2細(xì)胞中整合攜帶有互為反向Lox位點(diǎn)的靶載體,獲得的HYG<'r>-HepG2細(xì)胞株,可作為受體細(xì)胞株(recipient cell strains)用于在特定的染色質(zhì)環(huán)境下順式作用元件的大規(guī)